Мэдээ

Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Энэ хооронд байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг ямар ч загвар, JavaScript-гүйгээр үзүүлэх болно.
Идэвхжүүлсэн эфир эсвэл фенокси радикалууд дээр суурилсан ферментийн ойрын шошгоны аргуудыг амьд эс дэх эсийн доорх протеомууд болон уургийн харилцан үйлчлэгчдийг зураглахад өргөн хэрэглэгддэг.Гэсэн хэдий ч идэвхжүүлсэн эфирүүд нь бага реактив байдаг тул шошгоны өргөн радиустай байдаг ба хэт ислийн боловсруулалтаар үүссэн фенокси радикалууд нь исэлдэлтийн замд саад учруулдаг.Энд бид miniSOG гэрэл мэдрэмтгий уургийг сонирхож буй уурагтай генетикийн хувьд холбох замаар боловсруулсан ойрын хаяглалтаас хамааралтай фото идэвхжүүлэх (PDPL) аргыг мэдээлж байна.Цэнхэр гэрлээр өдөөгдөж, өртөх хугацаагаар хянагддаг, сингл хүчилтөрөгч үүсч, дараа нь анилин датчикаар гистидиний үлдэгдлийг орон зайн цаг хугацаанд нь шийддэг тэмдэглэгээнд хүрдэг.Бид түүний өндөр үнэнч байдлыг органеллд зориулсан протеомын зураглалаар харуулж байна.PDPL-ийг TurboID-тэй зэрэгцүүлэн харьцуулах нь PDPL-ийн илүү тодорхой бөгөөд иж бүрэн протеомик хамрах хүрээг харуулж байна.Дараа нь бид PDPL-ийг өвчинтэй холбоотой транскрипцийн коактиватор BRD4 ба E3 Parkin ligase-д хэрэглэж, урьд өмнө мэдэгдээгүй харилцан үйлчлэгчдийг олсон.Хэт их экспрессийн скринингээр Паркины хувьд үл мэдэгдэх хоёр субстрат болох Ssu72 ба SNW1-ийг илрүүлсэн бөгөөд тэдгээрийн задрал нь ubiquitination-протеазомын замаар дамждаг.
Уургийн сүлжээний нарийн шинж чанар нь эсийн олон үндсэн үйл явцын үндэс суурь болдог.Тиймээс уургийн харилцан үйлчлэлийн өндөр нарийвчлалтай орон зайн цаг хугацааны зураглал нь биологийн зам, өвчний эмгэгийг тайлж, эмчилгээний зорилгоор эдгээр харилцан үйлчлэлийг тасалдуулах молекулын үндэс болно.Үүний тулд амьд эс эсвэл эд эс дэх түр зуурын харилцан үйлчлэлийг илрүүлэх аргуудыг маш их хүсч байна.Ойролцоо цэвэршүүлэх массын спектрометрийг (AP-MS) сонирхож буй уургийн (POI) холбох түншүүдийг тодорхойлоход түүхэндээ ашиглаж ирсэн.Тоон протеомикийн аргуудыг хөгжүүлснээр AP-MS дээр суурилсан уургийн сүлжээний хамгийн том мэдээллийн сан болох Bioplex3.0 бий болсон.Хэдийгээр AP-MS нь маш хүчтэй боловч ажлын урсгал дахь эсийн задрал ба шингэрүүлэх үе шатууд нь сул, түр зуурын холболтын харилцан үйлчлэлд чиглэгддэг бөгөөд задралын өмнө хуваагдалгүй хуурамч харилцан үйлчлэлийн хос гэх мэт задралын дараах олдворуудыг нэвтрүүлдэг.
Эдгээр асуудлыг шийдвэрлэхийн тулд хөндлөн холбоос бүхий бүлгүүдтэй байгалийн бус амин хүчлүүд (UAA), ойролцоох ферментийн шошго (PL) платформууд (жишээлбэл, APEX болон BioID)5 боловсруулсан.Хэдийгээр UAA аргыг олон хувилбарт амжилттай хэрэглэж, шууд уургийн цавууны талаар мэдээлэл өгдөг ч UAA оруулах талбайг оновчтой болгох шаардлагатай хэвээр байна.Хамгийн чухал нь энэ нь шошгоны үйл явдлын каталитик урвуу чанаргүй стехиометрийн шошгоны арга юм.Үүний эсрэгээр, BioID арга гэх мэт ферментийн PL аргууд нь инженерчлэгдсэн биотин лигазыг POI7 болгон нэгтгэж, улмаар биотиныг идэвхжүүлж, реактив биотинил-АМФ эфирийн завсрын бүтээгдэхүүнийг үүсгэдэг.Ийнхүү фермент нь идэвхжсэн биотин "үүл"-ийг катализ болгож, проксимал лизин үлдэгдлийг ялгаруулдаг.Гэсэн хэдий ч BioID нь хангалттай шошготой дохио авахын тулд 12 цагаас илүү хугацаа шаарддаг бөгөөд энэ нь түүнийг түр зуурын нарийвчлалтайгаар ашиглахад саад болдог.Мөөгөнцрийн дэлгэц дээр суурилсан чиглэсэн хувьслыг ашиглан TurboID нь BioID дээр суурилсан илүү үр ашигтай байхаар бүтээгдсэн бөгөөд 10 минутын дотор биотиныг үр дүнтэй шошгож, илүү динамик үйл явцыг судлах боломжийг олгодог.TurboID нь маш идэвхтэй бөгөөд эндоген биотин нь доод түвшний шошгололтод хангалттай байдаг тул экзоген биотин нэмснээр өндөр сайжруулсан, цаг хугацаатай шошго шаардлагатай үед дэвсгэр шошго нь болзошгүй асуудал болдог.Нэмж дурдахад идэвхижүүлсэн эфирүүд нь урвалд орох чадвар муутай (t1/2 ~5 мин) бөгөөд энэ нь ялангуяа хөрш уургуудыг биотин 5-аар ханасаны дараа том тэмдэглэгээний радиус үүсгэдэг. Өөр нэг аргад инженерийн аскорбат пероксидазын генетикийн нэгдэл (өөрөөр хэлбэл биотин- фенолын радикалуудыг үүсгэдэг ба нэг минутын дотор уургийн шошгололтыг зөвшөөрдөг9,10. APEX нь эсийн доорх протеомууд, мембраны уургийн цогцолборууд болон цитозолын дохионы уургийн цогцолборуудыг тодорхойлоход өргөн хэрэглэгддэг.11,12 Гэсэн хэдий ч хэт ислийн өндөр концентрацийн хэрэгцээ нь исэлдэлтийн уураг эсвэл замд нөлөөлж, исэлдүүлэх уураг эсвэл замд нөлөөлж болно. эсийн үйл явц.
Тиймээс эсийн замыг ихээхэн тасалдуулахгүйгээр орон зайн болон цаг хугацааны өндөр нарийвчлалтай, илүү идэвхтэй хаяглагдсан радиус дарах төрлийг бий болгох шинэ арга нь одоо байгаа аргуудын чухал нэмэлт болно. Реактив төрлүүдийн дотроос сингл хүчилтөрөгч нь богино наслалт, тархалтын радиус хязгаарлагдмал (эсэд t1/2 < 0.6 мкс)13 тул бидний анхаарлыг татсан. Реактив төрлүүдийн дотроос сингл хүчилтөрөгч нь богино наслалт, тархалтын радиус хязгаарлагдмал (эсэд t1/2 < 0.6 мкс)13 тул бидний анхаарлыг татсан. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в эсүүд)13. Идэвхтэй хэлбэрүүдийн дотроос сингл хүчилтөрөгч нь богино наслалт, тархалтын радиус хязгаарлагдмал (эсэд t1/2 < 0.6 мкс)13 тул бидний анхаарлыг татсан.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 μs 单线态氧因其 1/2 < 0.6 μs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни болон ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в эсийн). Идэвхтэй хэлбэрүүдийн дотроос сингл хүчилтөрөгч нь богино наслалт, тархалтын радиус хязгаарлагдмал (эсэд t1/2 < 0.6 мкс) учраас бидний анхаарлыг татдаг.Ганц хүчилтөрөгч нь метионин, тирозин, гистидин, триптофаныг санамсаргүй байдлаар исэлдүүлж, амин эсвэл тиол дээр суурилсан датчиктай холбоход туйл 14,15 болгодог16,17.Хэдийгээр сингл хүчилтөрөгчийг эс доторх тасалгааны РНХ-г шошголоход ашигладаг байсан ч эндоген POI-ийн ойрын шинж тэмдгийг дахин ашиглах стратеги судлагдаагүй хэвээр байна.Энд бид фото идэвхижүүлэлтээс хамааралтай ойрын шошго (PDPL) хэмээх платформыг танилцуулж байна. Энд бид miniSOG гэрэл мэдрэмтгийлэгчтэй нийлсэн POI-г гэрэлтүүлж, ойрын үлдэгдлийг исэлдүүлэхийн тулд сингл хүчилтөрөгч үүсгэх, дараа нь химийн датчикийг исэлдүүлэхийн тулд амин агуулсан өөрчлөлтүүдийг өдөөх зорилгоор цэнхэр гэрлийг ашигладаг. завсрын амьд эсүүд..Бид шошгоны өвөрмөц байдлыг нэмэгдүүлэхийн тулд химийн датчикуудыг туршиж, нээлттэй протеомикийн ажлын урсгалыг ашиглан өөрчлөлт хийх газруудыг тодорхойлсон.PDPL-ийг TurboID-тэй зэрэгцүүлэн харьцуулах нь PDPL-ийн илүү тодорхой бөгөөд иж бүрэн протеомик хамрах хүрээг харуулж байна.Бид энэ аргыг хорт хавдартай холбоотой эпигенетик зохицуулагч уураг BRD4 болон Паркинсоны өвчинтэй холбоотой E3 лигаз Паркиныг холбогч хамтрагчдыг эсийн доорх протеомын ерөнхий протеомын өвөрмөц маркеруудыг тодорхойлоход ашигласан бөгөөд энэ нь мэдэгдэж байгаа болон үл мэдэгдэх уургийн сүлжээг баталгаажуулсан. харилцан үйлчлэл..PDPL-ийн том уургийн цогцолбор дахь E3 субстратыг таних чадвар нь шууд бус холбогчийг таних шаардлагатай нөхцөл байдлыг илэрхийлдэг.Убиквитинаци-протеазомоор зуучлагдсан хоёр үл мэдэгдэх паркины субстрат газар дээр нь батлагдсан.
Фотодинамик эмчилгээ (PDT)19 ба хромофорын тусламжтай лазер идэвхгүйжүүлэх (CALI)20 нь гэрэл мэдрэмтгий бодисоор гэрлийн цацраг туяагаар сингл хүчилтөрөгч үүсгэдэг нь зорилтот уургийг идэвхгүйжүүлэх эсвэл эсийн үхэлд хүргэдэг.Синглет хүчилтөрөгч нь онолын хувьд 70 нм орчим тархах зайтай өндөр урвалд ордог бодис тул гэрэл мэдрэмтгийлэгчийн эргэн тойронд орон зайн хязгаарлагдмал исэлдэлтийг хянах боломжтой.Энэхүү үзэл баримтлалд үндэслэн бид амьд эс дэх уургийн цогцолборыг нарийн тэмдэглэж авахын тулд сингл хүчилтөрөгч ашиглахаар шийдсэн.Бид дөрвөн функцийг гүйцэтгэхийн тулд PDPL химопротеомик аргыг боловсруулсан: (1) PL ферментийн аргатай төстэй идэвхтэй сингл хүчилтөрөгчийг үүсгэх;(2) гэрлийн эхлэл дээр цаг хугацааны шийдэл бүхий шошгыг өгөх;(3) өөрчлөх замаар (4) Арын дэвсгэрийг багасгахын тулд эндоген кофакторыг (биотин гэх мэт) ашиглахаас зайлсхийх эсвэл хүрээлэн буй орчны стресст эсийн өртөлтийг багасгахын тулд маш их цочирдуулдаг экзоген урвалжуудыг (хэт исэл гэх мэт) ашиглахгүй байх.
Гэрэл мэдрэмтгийлэгч бодисыг жижиг молекул жинтэй флюрофорууд (жишээ нь сарнайн бенгал, метилен хөх)22 ба генетикийн хувьд кодлогдсон жижиг уураг (жишээ нь miniSOG, KillerRed)23 гэсэн хоёр ангилалд хувааж болно.Модульчлагдсан загварт хүрэхийн тулд бид PDPL платформыг POI24,25-д гэрэл мэдрэмтгий болгох (PS) уураг нэмснээр эхний үеийн PDPL платформыг боловсруулсан (Зураг 1a).Цэнхэр гэрлээр цацруулсан үед сингл хүчилтөрөгч нь проксимал нуклеофилийн амин хүчлийн үлдэгдлийг исэлдүүлдэг бөгөөд үүний үр дүнд электрофиль шинж чанартай umpolung туйлшрал үүсдэг ба амин мэдрэгчтэй нуклеофилуудтай цаашид урвалд орж болно16,17.Уг датчик нь LC/MS/MS шинж чанарыг тодорхойлохын тулд товшилтын химийн болон доош татах боломжийг олгодог алкин бариулаар бүтээгдсэн.
miniSOG-ийн зуучлалын уургийн цогцолборын шошгоны бүдүүвч зураг.Цэнхэр гэрэлд өртөх үед miniSOG-POI-ийг илэрхийлдэг эсүүд нь сингл хүчилтөрөгч үүсгэдэг бөгөөд энэ нь харилцан үйлчлэлцдэг уурагуудыг өөрчилдөг боловч холбогддоггүй уураг үүсгэдэггүй.Фото исэлдэлтийн завсрын бүтээгдэхүүнүүд нь амин химийн датчикийн реле шошгонд саад болж ковалент нэмэлт бодис үүсгэдэг.Химийн датчик дээрх алкинил бүлэг нь товшилтоор товшилтоор баяжуулж, дараа нь LC-MS/MS хэмжилт хийх боломжийг олгодог.б Амин датчикийн химийн бүтэц 1-4.c 1-4-р датчик ашиглан митохондрийн локалчлагдсан miniSOG зуучлалтай протеомик маркеруудын флюресцент гель шинжилгээ ба гель нягтометрт суурилсан харьцангуй хэмжигдэхүүн.Химийн датчикуудын дохио ба дэвсгэрийн харьцааг цэнхэр гэрлийг оруулаагүй сөрөг хяналтын туршилт эсвэл miniSOG илэрхийлэлгүй HEK293T эсийг ашиглан үнэлэв.n = 2 биологийн бие даасан дээж.Цэг бүр биологийн хуулбарыг илэрхийлдэг.d PDPL-ийн заасан бүрэлдэхүүн хэсгүүд байгаа эсвэл байхгүй үед оновчтой 3-р сорьцыг ашиглан PDPL-ийн төлөөлөгчийн илрүүлэлт, тоон үзүүлэлт c.n = 3 биологийн бие даасан дээж.Цэг бүр биологийн хуулбарыг илэрхийлдэг.Төвийн шугам ба сахал нь дундаж ба ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Алс улаан Si-DMA толбо бүхий сингл хүчилтөрөгчийн төвлөрсөн дүрслэл.Хуваарийн мөр: 10 микрон.Гель дүрслэл болон төвлөрсөн туршилтыг бие даан давтаж, дор хаяж хоёр удаа ижил төстэй үр дүнд хүрсэн.
Бид эхлээд HEK293T-д тогтвортой илэрхийлэгдсэн боловсорч гүйцсэн гэрэл мэдрэмтгий болгодог miniSOG26 ба KillerRed23-ийн протеомын пропаргиламин шошгыг химийн датчик болгон зуучлах чадварыг туршиж үзсэн (Нэмэлт зураг 1a).Гель флуоресценцийн шинжилгээ нь miniSOG болон цэнхэр гэрлийн цацрагийг ашиглан протеомын бүхэл бүтэн шошгоны тэмдэглэгээг хийсэн бол KillerRed дээр харагдахуйц шошгоны бүтээгдэхүүн ажиглагдаагүй болохыг харуулсан.Дохио-арын харьцааг сайжруулахын тулд бид дараа нь анилин (1 ба 3), пропиламин (2), бензиламин (4) агуулсан химийн датчикуудыг туршиж үзсэн.Бид HEK293T эсүүд нь хөх гэрэл байхгүйтэй харьцуулахад өндөр дэвсгэр дохиотой байгааг ажигласан бөгөөд энэ нь эндоген рибофлавины гэрэл мэдрэмтгийлэгч флавин мононуклеотид (FMN) 27-тэй холбоотой байж магадгүй юм. Анилин дээр суурилсан химийн датчик 1 ба 3 нь илүү сайн өвөрмөц байдлыг өгсөн бөгөөд HEK293T нь митохондрид miniSOG-ийг тогтвортой илэрхийлж, 3-р датчикийн дохиог 8 дахин ихэсгэж, харин РНХ шошголох аргад ашигласан датчик 2 нь зөвхөн ~2.5-ыг харуулж байна. РНХ болон уургийн хоорондох урвалын өөр өөр сонголттой холбоотой байж магадгүй (Зураг 1b, c). Анилин дээр суурилсан химийн датчик 1 ба 3 нь илүү сайн өвөрмөц байдлыг өгсөн бөгөөд HEK293T нь митохондрид miniSOG-ийг тогтвортой илэрхийлж, 3-р датчикийн дохиог 8 дахин ихэсгэж, харин РНХ шошголох аргад ашигласан датчик 2 нь зөвхөн ~2.5-ыг харуулж байна. РНХ болон уургийн хоорондох урвалын өөр өөр сонголттой холбоотой байж магадгүй (Зураг 1b, c).Анилин дээр суурилсан химийн датчик 1 ба 3 нь илүү сайн өвөрмөц байдлыг харуулсан: митохондри дахь miniSOG-ийг тогтвортой илэрхийлдэг HEK293T нь 3-р датчикийн дохионы хэмжээ 8 дахин их байгааг харуулж байгаа бол CAP-seq РНХ шошгоны аргад ашигласан датчик 2 нь зөвхөн РНХ ба уургийн хоорондох урвалын өөр өөр сонголттой холбоотой дохионы ~2.5 дахин ихсэхийг харуулж байна (Зураг 1b, c).基于 基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 更 的 特异性 特异性 中 中 中 中 中 中 中 中 于 于 表达 于 于 于 于 于 于 于 于 于 中 于 于 于 于 于 的 于 的 的 于 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c＂基于 基于 苯胺 的 化学 探针 1 具有 3 具有 更 特异性 特异性 特异性 粒体 增加 增加 e e e e ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAАнилин дээр суурилсан химийн датчик 1 ба 3-ын өвөрмөц чанар илүү сайн, HEK293T митохондрид miniSOG-ийг тогтвортой илэрхийлж, 3-р датчик дохио 8 дахин ихэссэн бол CAP-seq РНХ шошгоны аргын 2-р датчик ердөө 2.5 дахин нэмэгдсэн байна.дохионд, магадгүй РНХ ба уургийн хоорондох өөр өөр урвалын сонголттой холбоотой (Зураг 1b, c).Нэмж дурдахад датчик 3 изомер болон гидразин датчикийг (5, 6, 7 датчик) туршсан нь датчик 3-ын оновчтой байдлыг баталгаажуулсан (Нэмэлт зураг 1b,c).Үүний нэгэн адил гель доторх флюресценцийн шинжилгээ нь бусад оновчтой туршилтын параметрүүдийг илрүүлсэн: цацрагийн долгионы урт (460 нм), химийн датчикийн концентраци (1 мМ), цацрагийн хугацаа (20 мин) (Нэмэлт зураг 2a–c).PDPL протоколын аль нэг бүрэлдэхүүн хэсэг эсвэл алхамыг орхигдуулсан нь дохионы дэвсгэр рүү ихээхэн урвуу нөлөө үзүүлсэн (Зураг 1d).Синглет хүчилтөрөгчийг унтраадаг натрийн азид эсвэл тролокс агуулагдах үед уургийн шошго мэдэгдэхүйц багассан.Ганц биет хүчилтөрөгчийг тогтворжуулдаг D2O байгаа нь шошгоны дохиог сайжруулдаг.Бусад реактив хүчилтөрөгчийн төрлүүдийн шошгололтод оруулсан хувь нэмрийг судлахын тулд гидроксил ба хэт исэл радикалыг устгах бодисыг бий болгохын тулд маннитол болон витамин С-ийг тус тус нэмсэн, 18, 29, гэхдээ тэдгээр нь шошгыг бууруулдаг болохыг илрүүлээгүй.H2O2 нэмсэн боловч гэрэлтүүлгийн нөлөөгөөр шошго гарахгүй (Нэмэлт зураг 3a).Si-DMA датчик бүхий флюресценцийн сингл хүчилтөрөгчийн дүрслэл нь HEK293T-miniSOG утсанд сингл хүчилтөрөгч байгааг баталсан боловч анхны HEK293T утсанд биш юм.Нэмж дурдахад mitoSOX Red нь гэрэлтүүлгийн дараа хэт исэл үүсэхийг илрүүлж чадаагүй (Зураг 1e ба Нэмэлт зураг 3б) 30. Эдгээр өгөгдөл нь сингл хүчилтөрөгч нь дараагийн протеомик шошгыг хариуцдаг реактив хүчилтөрөгч гэдгийг баттай харуулж байна.PDPL-ийн цитотоксик чанарыг цэнхэр гэрлийн цацраг, химийн датчик зэрэг үнэлсэн бөгөөд мэдэгдэхүйц эсийн хоруу чанар ажиглагдаагүй (Нэмэлт Зураг 4a).
Шошгоны механизмыг судалж, LC-MS/MS ашиглан уургийн цогцолборын протеомикийг тодорхойлохын тулд бид эхлээд ямар амин хүчлүүд өөрчлөгдсөн, датчик шошгоны дельта массыг тодорхойлох хэрэгтэй.Метионин, гистидин, триптофан, тирозин нь сингл хүчилтөрөгчөөр өөрчлөгддөг гэж мэдээлсэн байна14,15.Бид TOP-ABPP31 ажлын урсгалыг MSFragger32 дээр суурилсан FragPipe тооцооллын платформоос өгсөн шударга нээлттэй хайлттай нэгтгэдэг.Хүчилтөрөгчийн сингл өөрчлөлт болон химийн датчикийн шошгололтын дараа задрах холбоос агуулсан биотиныг бууруулах шошгыг ашиглан товшилтын химийн шинжилгээ хийж, дараа нь нейтравидин суналт, трипсин шингээлтийг хийсэн.Өөрчлөгдсөн пептидийг давирхайтай холбосон хэвээр байгаа тул LC-MS/MS шинжилгээнд зориулж гэрэл зургийн хальснаа задалсан (Зураг 2a ба Нэмэлт мэдээлэл 1).Жагсаалтад орсон 50 гаруй пептидийн газрын зураг (PSM) бүхий протеомын туршид олон тооны өөрчлөлтүүд гарсан (Зураг 2b).Гайхалтай нь бид зөвхөн гистидиний өөрчлөлтийг ажигласан бөгөөд энэ нь бусад амин хүчлүүдээс илүү исэлдсэн гистидин нь анилин зондуудад илүү их хариу үйлдэл үзүүлдэгтэй холбоотой юм.Гистидиний сингл хүчилтөрөгчөөр исэлдэлтийн нийтлэгдсэн механизмын дагуу 21,33 санал болгож буй дельта-массын бүтэц +229 Да нь хоёр исэлдэлтийн дараа датчик 3-ын 2-оксо-гистидинтэй нийлүүлэлттэй тохирч байгаа бол +247 Да нь гидролизийн бүтээгдэхүүн юм. -ийн +229 Да (Нэмэлт зураг 5).MS2 спектрийн үнэлгээ нь өөрчлөгдсөн фрагмент ионуудыг (y ба b) тодорхойлох зэрэг y ба b ионуудын ихэнхийг тодорхойлох өндөр найдвартай байдлыг харуулсан (Зураг 2c).PDPL-өөр өөрчилсөн гистидиний орон нутгийн дарааллын контекст шинжилгээ нь ±1 байрлал дахь жижиг гидрофобик үлдэгдэлд дунд зэргийн мотивийг илүүд үздэг болохыг илрүүлсэн (Нэмэлт зураг 4б).Уурганд дунджаар 1.4 гистидин илэрсэн бөгөөд эдгээр маркеруудын байршлыг уусгагчд хүрэх боломжтой гадаргуугийн талбай (SASA) болон уусгагчийн харьцангуй олдоц (RSA) шинжилгээгээр тодорхойлсон (Нэмэлт Зураг 4c,d).
MSFragger-ээр ажилладаг FragPipe тооцооллын платформыг ашиглан үлдэгдэл сонгомол байдлыг судлахад зориулсан шударга бус ажлын урсгал.Стрептавидины давирхайгаас өөрчлөгдсөн пептидийн фото задралыг зөвшөөрөхийн тулд Cleavable linkers-ийг Click chemistry-д ашигладаг.Олон тооны өөрчлөлт, түүнчлэн холбогдох үлдэгдлийг тодорхойлох нээлттэй хайлтыг эхлүүлсэн.b Протеомын туршид тохиолдох өөрчлөлтийн массыг оноо.Пептидийн зураглал PSM.c 3-р датчикаар өөрчлөгдсөн гистидиний талбайн MS2 спектрийн тайлбар. Жишээ болгон 3-р датчиктай ковалент урвал нь өөрчлөгдсөн амин хүчилд +229.0938 Да нэмсэн.d PDPL маркерыг шалгахад ашигладаг мутацийн шинжилгээ.PRDX3 (H155A, H225A) болон PRDX1 (H10A, H81A, H169A) тугны эсрэг илрүүлэх зорилгоор зэрлэг төрлийн плазмидаар нэвчилт хийсэн.e Синтетик пептидийг датчик 3-ын дэргэд цэвэршүүлсэн miniSOG-тэй урвалд оруулж, Δm +247 ба +229-тэй харгалзах бүтээгдэхүүнийг LC-MS спектрт тэмдэглэв.f in vitro уураг-уургийн харилцан үйлчлэлийг miniSOG-6xHis-tag болон эсрэг-6xHis эсрэгбиемээр загварчилсан.Антибиотин (стрептавидин-HRP) ба хулганы эсрэг Western blot шинжилгээнд гэрэлд өртөх хугацаанаас хамаарч датчик 3-аар тэмдэглэгдсэн miniSOG-6xHis/anti-6xHis эсрэгбиеийн цогцолборууд.Хувь хүний ​​уургийн шошгыг харгалзах молекул жингээр илэрхийлнэ: LC эсрэгбиеийн хөнгөн гинж, HC эсрэгбиеийн хүнд гинж.Эдгээр туршилтыг дор хаяж хоёр удаа бие даан давтаж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн.
Шошгоны талбайн биохимийн баталгаажуулалтыг хийхийн тулд масс спектрометрээр тодорхойлсон PRDX3 ба PRDX1-ийг гистидинээс аланин болгон сольж, трансфекцияны шинжилгээнд зэрлэг төрөлтэй харьцуулсан.PDPL-ийн үр дүн нь мутаци нь шошгыг мэдэгдэхүйц бууруулсан болохыг харуулсан (Зураг 2d).Үүний зэрэгцээ, задгай хайлтаар тодорхойлогдсон пептидийн дарааллыг нэгтгэж, in vitro-д цэвэршүүлсэн miniSOG-тай датчик 3, цэнхэр гэрлийн нөлөөгөөр урвалд оруулснаар LC-MS-ээр илэрсэн үед массын шилжилт +247 ба +229 Да-ийн бүтээгдэхүүн гарч ирэв (Зураг 1). 2e).).MiniSOG фото идэвхжүүлэлтийн хариуд харилцан үйлчлэлцдэг проксимал уургуудыг in vitro байдлаар тэмдэглэж болох эсэхийг шалгахын тулд miniSOG-6xHis уураг болон түүний эсрэг моноклональ эсрэгбиеийн хоорондын харилцан үйлчлэлээр хиймэл ойрын шинжилгээг зохион бүтээсэн (Зураг 2f).Энэхүү шинжилгээнд бид эсрэгбиеийн хүнд ба хөнгөн гинжийг miniSOG-тэй ойрын шошгон дээр тэмдэглэсэн байх ёстой.Үнэн хэрэгтээ, хулганы эсрэг (anti-6xHis-ийн эсрэгбиеийн хүнд ба хөнгөн гинжийг таних) ба стрептавидины барууны толбо нь хүнд ба хөнгөн гинжний хүчтэй биотинилжилтийг харуулсан.Бид 6xHis шошго болон хөнгөн ба хүнд гинж хоорондын хөндлөн холбоосын улмаас miniSOG автобиотиниляцийг анзаарсан бөгөөд энэ нь лизин ба 2-оксо-гистидиний проксимал хариу урвалын хооронд өмнө нь тайлбарласан зөрүүтэй холбоотой байж болох юм.Эцэст нь хэлэхэд, PDPL нь гистидинийг ойроос хамааралтай байдлаар өөрчилдөг гэж бид дүгнэж байна.
Бидний дараагийн зорилго бол in situ тэмдэглэгээний өвөрмөц байдлыг шалгахын тулд эсийн дэд эсийн шинж чанарыг тодорхойлох явдал байв.Тиймээс бид HEK293T эсийн цөм, митохондрийн матриц эсвэл гаднах ER мембранд miniSOG-ийг тогтвортой илэрхийлсэн (Зураг 3a).Гель флуоресценцийн шинжилгээгээр гурван дэд эсийн байршилд их хэмжээний шошготой тууз, түүнчлэн өөр өөр тэмдэглэгээний хэв маягийг илрүүлсэн (Зураг 3b).Флюресценцийн дүрслэлийн шинжилгээ нь PDPL-ийн өндөр өвөрмөц байдлыг харуулсан (Зураг 3c).PDPL-ийн ажлын урсгалын дараа флюресценцийн микроскоп ашиглан дэд эсийн протеомуудыг тодорхойлохын тулд родамин будагч бодисоор товших урвал явуулсан ба PDPL дохиог DAPI, митохондрийн трекер эсвэл ER трекерээр хамтад нь нэгтгэсэн нь PDPL-ийн өндөр үнэнч байдлыг баталгаажуулсан.Гурван эрхтэний байршлын хувьд avidin western blot ашиглан PDPL-ийг TurboID-тэй зэрэгцүүлэн харьцуулж үзэхэд PDPL-ийг тус тусын хяналттай харьцуулахад илүү тодорхой тэмдэглэсэн болохыг харуулсан.PDPL-ийн нөхцөлд илүү олон шошготой туузууд гарч ирсэн нь PDPL шошготой илүү олон уураг байгааг харуулж байна (Нэмэлт зураг 6a-d).
miniSOG-ийн зуучлагч органелл-тусгай протеомын шошгоны бүдүүвч дүрслэл.miniSOG нь хүний ​​COX4 (мито-miniSOG) N-терминал 23 амин хүчлүүдтэй, цөмийг H2B (цөм-miniSOG) болон ER мембраны цитоплазмын талаас (ER-miniSOG) Sec61β-тэй нэгтгэх замаар митохондрийн матрицыг чиглүүлдэг. ).Заалтууд нь гель дүрслэл, төвлөрсөн дүрслэл, масс спектрометр зэрэг орно.b Гурван органеллд хамаарах PDPL профайлын төлөөлөл гель зураг.CBB Coomassie Brilliant Blue.c V5 (улаан) шошготой эсрэгбиемээр илрүүлсэн янз бүрийн дэд эсийн локализаци бүхий miniSOG-ийг тогтвортой илэрхийлдэг HEK293T эсийн төлөөллийн төвлөрсөн зургууд.Дэд эсийн маркеруудыг митохондри болон ER (ногоон) -д ашигладаг.PDPL ажлын урсгал нь Cy3-azide товшилтын химийн аргыг ашиглан miniSOG (шар) шошготой дэд эсийн протеомуудыг илрүүлэхийг агуулдаг.Хуваарийн мөр: 10 микрон.d Төрөл бүрийн органелл дахь PDPL шошготой протеомуудын галт уулын графикийг шошгогүй тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон (n = 3 бие даасан биологийн туршилт).Хоёр сүүлт Студентийн t-тестийг галт уулын талбайд ашигласан.HEK293T зэрлэг төрлийг сөрөг хяналт болгон ашигласан. Их хэмжээгээр өөрчлөгдсөн уурагуудыг улаанаар тодруулсан (p <0.05 ба >2 дахин их ионы эрчимжилтийн зөрүү). Их хэмжээгээр өөрчлөгдсөн уурагуудыг улаанаар тодруулсан (p <0.05 ба >2 дахин их ионы эрчимжилтийн зөрүү). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ба >2-кратная разница в интенсивности ионов). Их хэмжээгээр өөрчлөгдсөн уургуудыг улаан өнгөөр ​​тодруулсан (p<0.05 ба ионы эрчимийн >2 дахин зөрүү).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Их хэмжээгээр өөрчлөгдсөн уургуудыг улаан өнгөөр ​​тодруулсан (p < 0.05 ба > ионы бат бэхийн зөрүү 2 дахин их).HEK293T-miniSOG-д чухал боловч HEK293T-д чухал биш холбогдох уурагуудыг ногоон өнгөөр ​​харуулсан.e Туршилтын протеомик мэдээллийн багцын өвөрмөц байдлын шинжилгээ d.Органелл тус бүрийн статистикийн ач холбогдол бүхий уургийн нийт тоог (улаан ба ногоон цэгүүд) дээд талд тэмдэглэв.Гистограммууд нь MitoCarta 3.0, GO шинжилгээ болон A. Ting et al.-д үндэслэсэн органеллд нутагшсан уурагуудыг харуулдаг.хүмүүс.Митохондри, цөм, ER-ийн тусдаа мэдээллийн багц.Эдгээр туршилтыг дор хаяж хоёр удаа бие даан давтаж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн.Түүхий өгөгдлийг түүхий өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгдөг.
Гель болон дүрслэлийн үр дүнд урам зориг өгсөн бөгөөд шошгогүй тоон үзүүлэлтийг органелл тус бүрт тодорхойлсон протеомыг тодорхойлоход ашигласан (Нэмэлт мэдээлэл 2).Шилжүүлээгүй HEK293T-ийг арын тэмдэглэгээг хасах сөрөг хяналт болгон ашигласан. Галт уулын талбайн шинжилгээнд ихээхэн баяжуулсан уураг (p < 0.05 ба >2 дахин их ионы эрчим) болон зөвхөн miniSOG илэрхийлэгч шугамд байдаг синглтон уураг (Зураг 3d улаан, ногоон цэгүүд) харуулсан. Галт уулын талбайн шинжилгээнд ихээхэн баяжуулсан уураг (p < 0.05 ба >2 дахин их ионы эрчим) болон зөвхөн miniSOG илэрхийлэгч шугамд байдаг синглтон уураг (Зураг 3d улаан, ногоон цэгүүд) харуулсан. Анализ график вулкана показал значительно обогощенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), мөн адил одиночные белки, линиях, экспрессирующих miniSOG, зэлэн только (рис. Галт уулын талбайн шинжилгээнд ихээхэн баяжуулсан уураг (p<0.05 ба >2 дахин их ионы эрчим) болон зөвхөн miniSOG илэрхийлэгч шугамд байдаг дан уураг (Зураг 3d, улаан, ногоон цэгүүд) харуулсан.火山图 火山图 分析 显示 出 显着 的 的 蛋白质 (p <0.05 和 和 和 离子 强度 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 (图 红色 红色 和 和 和 和 和).火山图 火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 (P <0.05 和 和 和 和 在于 在于 单 单 单 单)))))))))) Анализ график вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отделные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Галт уулын талбайн шинжилгээнд мэдэгдэхүйц баяжуулсан уураг (p<0.05 ба >2x ионы хүч) болон зөвхөн miniSOG-ийн илэрхийлэлийн шугамд байдаг дан уураг илэрсэн (Зураг 3d дээрх улаан, ногоон цэгүүд).Эдгээр өгөгдлүүдийг нэгтгэн бид 1364, 461, 911 статистик ач холбогдолтой цөмийн, митохондрийн болон ER гадна мембраны уургуудыг тус тус тодорхойлсон.Органеллээр нутагшсан PDPL-ийн нарийвчлалыг шинжлэхийн тулд бид MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) шинжилгээ, A. Ting et al.өгөгдлийн багц8-ийг митохондри, цөм, ER-д ашигласан бөгөөд илрүүлсэн уургийн органеллуудын өвөрмөц байдлыг шалгахад 73.4, 78.5, 73.0% нарийвчлалтай тохирч байна (Зураг 3e).PDPL-ийн өвөрмөц байдал нь PDPL нь тусгай эрхтэний протеомуудыг тодорхойлох хамгийн тохиромжтой хэрэгсэл гэдгийг баталж байна.Тодорхойлсон митохондрийн уургуудын субмитохондрийн шинжилгээгээр баригдсан протеом нь матриц болон дотоод мембранд (тус тус бүр 226 ба 106) тархсан болохыг харуулсан бөгөөд энэ нь тодорхойлсон митохондрийн уургийн нийт тооны 91.7% (362) -ийг эзэлдэг.PDPL-ийн өндөр түвшин нэмэлтээр батлагдсан (Нэмэлт Зураг 7a).Үүний нэгэн адил, дэд цөмийн шинжилгээгээр баригдсан протеом нь голчлон цөм, нуклеоплазм, цөмд тархсан болохыг харуулсан (Нэмэлт зураг 7b).Цөмийн нутагшуулах дохионы пептид (3xNLS) бүхий цөмийн протеомик шинжилгээ нь H2B бүтэцтэй ижил нарийвчлалтай болохыг харуулсан (Нэмэлт зураг 7c-h).PDPL маркерын өвөрмөц байдлыг тодорхойлохын тулд цөмийн ламинин А-г илүү тодорхой нутагшуулсан POI7 урхи болгон сонгосон.PDPL нь мэдэгдэхүйц баяжуулсан 36 уургийг тодорхойлсон бөгөөд тэдгээрийн 12 уураг (30.0% нь ламин А) нь BioID аргаас (122 уураг) илүү өндөр хувьтай, сайн шинж чанар бүхий А ламинтай харилцан үйлчлэлцдэг уургууд юм. 28. , 22.9 %) 7. Бидний арга нь шошгоны хязгаарлагдмал талбайн улмаас цөөн тооны уураг илрүүлсэн бөгөөд үүнийг илүү идэвхтэй сингл хүчилтөрөгчөөр хийсэн.GO шинжилгээгээр тодорхойлсон уургууд нь голчлон нуклеоплазм (26), цөмийн мембран (10), цөмийн мембран (9), цөмийн нүхэнд (5) байрладаг болохыг харуулсан.Цөмөөр нутагшсан эдгээр уургууд нь баяжуулсан уургийн 80%-ийг бүрдүүлдэг байсан нь PDPL-ийн өвөрмөц чанарыг харуулж байна (Нэмэлт Зураг 8a-d).
PDPL нь органеллд ойрын тэмдэглэгээ хийх чадварыг тогтоосны дараа бид PDPL-ийг POI холбох түншүүдийг шинжлэхэд ашиглаж болох эсэхийг шалгасан.Ялангуяа бид цитозолын уургийн PDPL шинжилгээг тодорхойлохыг эрэлхийлсэн бөгөөд тэдгээр нь өндөр динамик шинж чанартай байдаг тул мембраны орон нутгийн аналогиас илүү хэцүү зорилтот гэж тооцогддог.Bromodomain болон extraterminal (BET) уураг BRD4 нь янз бүрийн өвчинд гол үүрэг гүйцэтгэдэг тул бидний анхаарлыг татсан 35, 36 .BRD4-ийн үүсгэсэн цогцолбор нь транскрипцийн коактиватор бөгөөд эмчилгээний чухал зорилт юм.c-myc болон Wnt5a транскрипцийн хүчин зүйлсийн илэрхийлэлийг зохицуулснаар BRD4 нь цочмог миелоид лейкеми (AML), олон миелома, Буркиттийн лимфома, бүдүүн гэдэсний хорт хавдар, үрэвсэлт өвчнийг тодорхойлох гол хүчин зүйл гэж үздэг37,38.Нэмж дурдахад зарим вирусууд папилломавирус, ХДХВ, SARS-CoV-236,39 зэрэг вирусын болон эсийн транскрипцийг зохицуулахын тулд BRD4-ийг онилдог.
PDPL ашиглан BRD4-ийн харилцан үйлчлэлийн зураглалыг гаргахын тулд бид miniSOG-ийг BRD4-ийн богино N- эсвэл C-терминал изоформтой хослуулсан.Протеомикийн үр дүн нь хоёр бүтцийн хооронд өндөр түвшний давхцлыг илрүүлсэн (Нэмэлт зураг 9a).miniSOG-H2B-тэй тодорхойлогдсон цөмийн протеом нь BRD4-тэй харилцан үйлчилдэг уургийн 77.6%-ийг эзэлдэг (Нэмэлт зураг 9б).Дараа нь гэрэлтүүлгийн өөр өөр цагийг (2, 5, 10, 20 минут) тэмдэглэгээний радиусыг тохируулахад ашигласан (Зураг 4а ба нэмэлт өгөгдөл 3).Богино хугацааны фотопериодууд нь PDPL нь үндсэндээ шууд холбох түншүүдийг тэмдэглэдэг бол илүү урт хугацаанд богино хугацаанд гэрэл зургийн идэвхжүүлэлтийн үед тодорхойлсон уураг, түүнчлэн шошгоны цогцолбор дахь шууд бус зорилтуудыг багтаана гэж бид дүгнэж байна.Үнэн хэрэгтээ, бид зэргэлдээх цаг хугацааны цэгүүдийн хооронд хүчтэй давхцал байгааг олж мэдсэн (2 ба 5 минутын турш 84.6%; 5 ба 10 минутын турш 87.7%; 10 ба 20 минутын турш 98.7%) (Зураг 4б ба Нэмэлт зураг 9c).Туршилтын бүх бүлгүүдэд бид зөвхөн BRD4 өөрөө шошгололтыг бус, MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, HMGB1 зэрэг хэд хэдэн мэдэгдэж буй зорилтуудыг стринг мэдээллийн санд тэмдэглэсэн болохыг олж мэдсэн.Эдгээр зорилтуудын ионы хүч нь өртөх хугацаатай пропорциональ байна (Зураг 4c ба Нэмэлт зураг 9d).2 минутын бүлэгт тодорхойлсон уургийн GO шинжилгээ нь тодорхойлогдсон уургууд нь цөмд нутагшсан бөгөөд хроматиныг өөрчлөх, РНХ полимеразын үйл ажиллагаанд оролцдог болохыг харуулсан.Уургийн молекулын функц нь BRD4 функцтэй нийцсэн хроматиныг холбох буюу транскрипцийн коактивацаар баяжуулсан (Зураг 4d).Өгөгдлийн сангийн идэвхжүүлсэн уургийн харилцан үйлчлэлийн шинжилгээ нь BRD4 ба HDAC-тай холбосон ацетилжуулсан гистонтой нийцсэн SIN3A, NCOR2, BCOR, SAP130 (Зураг 4e ба Нэмэлт зураг 9e) зэрэг BRD4 ба HDAC гэр бүлийн харилцан үйлчлэлийн цогцолборуудын хооронд шууд бус харилцан үйлчлэлийн эхний түвшнийг илрүүлсэн. ..Нэмж дурдахад, LC-MS/MS-ийн тодорхойлсон зорилтот зорилтууд, тухайлбал Sin3A, NSUN2, Fus, SFPQ нь Western blotting-ээр батлагдсан (Зураг 4f).Сүүлийн үед BRD4-ийн богино изоформ нь шингэн-шингэн фазын тусгаарлалт (LLPS) шинж чанартай цөмүүдийг үүсгэдэг гэж мэдээлсэн.РНХ холбогч уураг болох Fus ба SFPQ нь эсийн янз бүрийн процессын LLPS-ийг зуучлагч бөгөөд энд бүртгэгдээгүй BRD4 холбогч уураг гэж тодорхойлсон.BRD4 ба SFPQ-ийн харилцан үйлчлэл нь дархлаажуулалтын (co-IP) туршилтаар батлагдсан (Зураг 4g) нь BRD4-ийн зуучлагч шингэн-шингэн фазыг салгах өөр нэг механизмыг цаашид судлах шаардлагатай байгааг харуулж байна.Эдгээр үр дүнг нэгтгэж үзвэл PDPL нь мэдэгдэж буй BRD4 болон үл мэдэгдэх холбогч уургуудыг тодорхойлоход тохиромжтой платформ гэдгийг харуулж байна.
a miniSOG зуучлалын BRD4 ойрын тэмдэглэгээний бүдүүвч дүрслэл, өртөх хугацаа: 2, 5, 10, 20 мин.b Гэрэлтүүлгийн янз бүрийн хугацаанд тодорхойлогдсон уургийн давхцал.HEK293T-miniSOG-BRD4-д тодорхойлсон уургийн баяжуулалт нь зэрлэг төрлийн HEK293T-тэй харьцуулахад статистикийн хувьд чухал байсан.c Тодорхойлсон өртөлтийн хугацаанд тэмдэглэгээгүй төлөөлөгч мэдэгдэж буй BRD4-тэй холбогч уургийн хэмжээг тодорхойлох үед ионы эрчим.n = 3 биологийн бие даасан дээж.Өгөгдлийг дундаж ± стандарт хазайлтаар үзүүлэв.d 2 минутын бүлэгт тодорхойлсон уургийн генийн онтологийн шинжилгээ (GO).Эхний арван GO нэр томъёог жагсаав.Бөмбөлөгүүд нь GO нэр томъёоны ангиллын дагуу өнгөтэй байдаг бөгөөд бөмбөлгийн хэмжээ нь нэр томъёо тус бүрт байгаа уургийн тоотой пропорциональ байна.e BRD4-тэй харилцан үйлчилдэг уургийн хэлхээний шинжилгээ.Шар дугуйнууд нь шууд цавуу, саарал дугуй нь шууд бус цавууны эхний давхарга юм.Улаан шугамууд нь туршилтаар тодорхойлсон харилцан үйлчлэлийг, цэнхэр шугамууд нь урьдчилан таамагласан харилцан үйлчлэлийг илэрхийлдэг.f LC-MS/MS-д тодорхойлсон BRD4-ийн төлөөлөгчийн зорилтуудыг Western blotting-ээр баталгаажуулсан.g Хамтарсан дархлаажуулалтын туршилтууд нь SFPQ болон BRD4 хоорондын харилцан үйлчлэлийг баталж байна.Эдгээр туршилтыг дор хаяж хоёр удаа бие даан давтаж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн.Түүхий өгөгдлийг түүхий өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгдөг.
Бүртгүүлээгүй POI-тэй холбоотой зорилтуудыг тодорхойлохоос гадна PDPL нь ферментийн субстратыг тодорхойлоход тохиромжтой гэж бид таамаглаж байгаа бөгөөд энэ нь бүртгэгдээгүй субстратуудыг тэмдэглэхийн тулд том цогцолбор дахь шууд бус холбох уургийн шинж чанарыг тодорхойлох шаардлагатай болно.Паркин (PARK2-р кодлогдсон) нь E3 ligase бөгөөд паркин дахь мутаци нь автосомын рецессив өсвөр насны Паркинсоны өвчин (AR-JP) үүсгэдэг нь мэдэгдэж байна42.Нэмж дурдахад паркин нь митофаги (митохондрийн аутофаги) болон реактив хүчилтөрөгчийн төрлүүдийг зайлуулахад зайлшгүй шаардлагатай гэж тодорхойлсон байдаг.Гэсэн хэдий ч хэд хэдэн паркины субстратыг тодорхойлсон боловч энэ өвчинд паркины үүрэг тодорхойгүй хэвээр байна.Тэмдэглэгдээгүй субстратыг тэмдэглэхийн тулд PDPL-ийг паркины N эсвэл C төгсгөлд miniSOG нэмж туршиж үзсэн.PINK1-Parkin замаар дамжин паркиныг идэвхжүүлэхийн тулд эсүүдийг карбонил цианидын протон зөөгч м-хлорфенилгидразон (CCCP) -ээр эмчилсэн.Манай BRD4 PDPL-ийн үр дүнтэй харьцуулахад паркин N-төгсгөлийн нэгдэл нь С төгсгөлийн илүү их хэсгийг (210-аас 177) хамарсан хэдий ч илүү том зорилтот уургийг илрүүлсэн (Зураг 5a,b ба Нэмэлт мэдээлэл 4).үр дүн нь N-терминал хаягууд нь Parkin44-ийг хэвийн бус идэвхжүүлдэг гэсэн мэдээлэлтэй нийцэж байна.Гайхалтай нь, Паркин43-ийн нийтлэгдсэн AP-MS-ийн үр дүн бүхий бидний мэдээлэлд зөвхөн 18 давхцсан уураг байсан бөгөөд энэ нь эсийн шугам болон протеомикийн ажлын урсгалын ялгаанаас үүдэлтэй байж магадгүй юм.Мэдэгдэж байгаа дөрвөн уурагаас гадна (ARDM1, HSPA8, PSMD14, PSMC3) хоёр аргаар тодорхойлсон (Зураг 5c)43.LC-MS/MS-ийн үр дүнг баталгаажуулахын тулд HEK293T эх эсийн шинжилгээ болон тогтвортой N-терминал паркины шугамын үр дүнг харьцуулахын тулд PDPL эмчилгээ, дараа нь Вестний blotting-ийг ашигласан.Өмнө нь үл мэдэгдэх зорилтот CDK2, DUT, CTBP1, PSMC4-ийг DNAJB1 нэртэй холбогчоор туршсан (Зураг 5d).
HEK293T эсүүд дэх паркинтай харилцан үйлчлэлцдэг уургийн галт уулын зураг, паркины N эсвэл C төгсгөлд ууссан тогтвортой илэрхийлэл бүхий miniSOG (n = 3 бие даасан биологийн туршилт).Хоёр сүүлт Студентийн t-тестийг галт уулын талбайд ашигласан.HEK293T-ийг сөрөг хяналт болгон ашигласан. Их хэмжээгээр өөрчлөгдсөн уурагуудыг улаанаар тодруулсан (p <0.05 ба >2 дахин их ионы эрчимжилтийн зөрүү). Их хэмжээгээр өөрчлөгдсөн уурагуудыг улаанаар тодруулсан (p <0.05 ба >2 дахин их ионы эрчимжилтийн зөрүү). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ба >2-кратная разница в интенсивности ионов). Их хэмжээгээр өөрчлөгдсөн уургуудыг улаан өнгөөр ​​тодруулсан (p<0.05 ба ионы эрчимийн >2 дахин зөрүү).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Их хэмжээгээр өөрчлөгдсөн уургуудыг улаан өнгөөр ​​тодруулсан (p < 0.05 ба > ионы бат бэхийн зөрүү 2 дахин их).HEK293T-miniSOG-д чухал боловч HEK293T-д чухал биш холбогдох уурагуудыг ногоон өнгөөр ​​харуулсан.б Венн диаграмм нь N-терминал ба С-терминалуудын хооронд давхцаж буй уургуудыг харуулсан.N-терминал шошгууд нь паркиныг хэвийн бус идэвхжүүлж, илүү танигдах уураг үүсгэдэг.c PDPL болон AP-MS хооронд давхцаж буй уургуудыг харуулсан Венн диаграмм.Мэдэгдэж буй харилцан үйлчлэгчдийг жагсаасан бөгөөд үүнд PDPL-д тусгайлан тодорхойлсон 18 давхардсан уургийн 4, 159 уургийн 11-ийг багтаасан болно.d LC-MS/MS-ээр тодорхойлсон төлөөлөгчийн зорилтуудыг Western blotting-ээр баталгаажуулсан.e Ssu72 болон SNW1 нь бүртгэгдээгүй паркин субстрат болохыг тогтоосон.Эдгээр ТУГ-ын шошготой уургийн плазмидуудыг HEK293T ба HEK293T-Parkin-miniSOG-д шилжүүлж, дараа нь янз бүрийн цаг хугацааны цэгүүдэд CCCP эмчилгээ хийлгэсэн.Паркины хэт илэрхийлэлийн шугамд доройтол илүү тод харагдаж байв.f Протеазомын дарангуйлагч MG132-ийг ашигласнаар Ssu72 ба SNW1-ийн задралын процесс нь протеазом-убикитинжуулалтаар дамждаг нь батлагдсан.Эдгээр туршилтыг дор хаяж хоёр удаа бие даан давтаж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн.Түүхий өгөгдлийг түүхий өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгдөг.
PDPL-ээр тодорхойлсон уургууд нь паркин холбогч уураг ба тэдгээрийн субстратуудыг агуулсан байх ёстой.Бүртгүүлээгүй паркин субстратуудыг илрүүлэхийн тулд бид тодорхойлсон долоон уураг (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 болон SNW1) болон трансфекцтэй плазмидыг сонгосон бөгөөд эдгээр генийг хэвийн HEK293T-д ил болгож, miniSOG-Parkin-ийн HEK293CC-ийн эмчилгээг тогтвортой илэрхийлэх болно.Тогтвортой miniSOG-Parkin шугамд Ssu72 болон SNW1 уургийн түвшин мэдэгдэхүйц буурсан байна (Зураг 5e).CCCP-тэй 12 цагийн турш эмчилгээ хийснээр хоёр субстратын хамгийн их доройтолд хүргэсэн.Ssu72 ба SNW1-ийн задрал нь протеазом-бүх хэсэгт хуваагдах замаар зохицуулагддаг эсэхийг судлахын тулд протеазомын дарангуйлагч MG132-ыг протеазомын үйл ажиллагааг дарангуйлах зорилгоор нэмсэн бөгөөд үнэндээ бид тэдгээрийн задралын процессыг дарангуйлдаг болохыг олж мэдсэн (Зураг 5f).Нэмэлт бус субстрат зорилтууд нь Western blotting (Нэмэлт зураг 10) ашиглан Паркины харилцан үйлчлэгч болохыг баталсан бөгөөд энэ нь LC-MS/MS-тэй нийцсэн үр дүнг харуулсан.Дүгнэж хэлэхэд, PDPL ажлын урсгалыг зорилтот уургийн дамжуулалтын баталгаажуулалттай нэгтгэх нь бүртгэлгүй E3 ligase субстратыг тодорхойлох боломжийг олгодог.
Бид орон зай, цаг хугацааны харилцан үйлчлэлийн POI-г тодорхойлох боломжийг олгодог нийтлэг ойрын тэмдэглэгээний платформыг боловсруулсан.Энэхүү платформ нь miniSOG гэрэл мэдрэмтгий болгодог уураг дээр суурилдаг бөгөөд энэ нь ердөө 12 кДа буюу боловсорч гүйцсэн APEX2 ферментийн хагасаас бага хэмжээтэй (27 кДа), TurboID (35 кДа) гуравны нэгтэй тэнцүү юм.Жижиг хэмжээтэй байх нь жижиг уургийн интерактомуудыг судлах хэрэглээний хүрээг ихээхэн өргөжүүлэх ёстой.Генетикийн кодлогдсон уураг эсвэл жижиг молекулын аль нь ч байсан нэмэлт гэрэл мэдрэмтгийлэгчдийг цаашид судлах нь сингл хүчилтөрөгчийн квантын гарцыг нэмэгдүүлэх, энэ аргын мэдрэмжийг өргөжүүлэх шаардлагатай байна.MiniSOG-ийн одоогийн хувилбарын хувьд ойрын тэмдэглэгээг идэвхжүүлэхийн тулд цэнхэр гэрэлтүүлгийг ашиглан цаг хугацааны өндөр нарийвчлалд хүрч болно.Нэмж дурдахад, удаан хугацаагаар өртөх нь сингл хүчилтөрөгчийн илүү том "үүл"-ийг ялгаруулж, илүү их дистал гистидиний үлдэгдэл өөрчлөгдөж, шошгоны радиус нэмэгдэж, PDPL орон зайн нарийвчлалыг нарийн тааруулах чадвартай болсон.Бид мөн дохио-арын харьцааг нэмэгдүүлэхийн тулд долоон химийн датчикийг туршиж, энэ аргын цаад молекулын механизмыг судалсан.Шударга бус нээлттэй хайлттай хослуулсан TOP-ABPP ажлын урсгал нь өөрчлөлтүүд зөвхөн гистидинд л тохиолдсоныг баталж, гогцооны бүсэд гистидинийг дунд зэргийн илүүд үздэгээс бусад тохиолдолд гистидиний өөрчлөлт ихсэх тууштай бичил орчин ажиглагдаагүй.
PDPL-ийг мөн протеомын өвөрмөц шинж чанар, хамрах хүрээ бүхий дэд эсийн протеомуудыг тодорхойлоход ашигладаг бөгөөд наад зах нь бусад ойрын тэмдэглэгээ, органеллд хамаарах химийн шинжилгээний аргуудтай харьцуулж болно.Ойролцоох тэмдэглэгээг мөн гадаргуу, лизосомын болон нууцтай холбоотой протеомуудыг тодорхойлоход амжилттай ашиглаж байна46,47.PDPL нь эдгээр дэд эсийн органеллуудтай нийцдэг гэдэгт бид итгэдэг.Нэмж дурдахад бид динамик шинж чанар, илүү цаг хугацааны харилцан үйлчлэлд оролцдог тул мембранаар холбогдсон уургуудаас илүү төвөгтэй байдаг цитозолын уурагтай холбох зорилтуудыг тодорхойлох замаар PDPL-ийг сорьсон.PDPL-ийг транскрипцийн коактиватор BRD4 ба өвчинтэй холбоотой лигаз E3 Паркин гэсэн хоёр уурагт хэрэглэсэн.Эдгээр хоёр уургийг зөвхөн биологийн үндсэн үйл ажиллагаанаас гадна эмнэлзүйн ач холбогдол, эмчилгээний чадамжаар нь сонгосон.Эдгээр хоёр POI-ийн хувьд сайн танигдсан түншүүд болон бүртгэгдээгүй зорилтуудыг тодорхойлсон.Ялангуяа фазын салалттай холбоотой уураг SFPQ нь ко-IP-ээр батлагдсан бөгөөд энэ нь BRD4 (богино изоформ) нь LLPS-ийг зохицуулдаг шинэ механизмыг илтгэж магадгүй юм.Үүний зэрэгцээ Паркины субстратыг тодорхойлох нь шууд бус цавууг тодорхойлох шаардлагатай хувилбар гэж бид үзэж байна.Бид хоёр үл мэдэгдэх паркины субстратыг тодорхойлж, ubiquitination-proteasome замын дагуу тэдгээрийн доройтлыг баталгаажуулсан.Саяхан гидролазын субстратуудыг ферментээр барих замаар илрүүлэх механизмд суурилсан барих стратегийг боловсруулсан.Хэдийгээр энэ нь маш хүчирхэг арга боловч том цогцолбор үүсэхэд оролцдог субстратын шинжилгээнд тохиромжгүй бөгөөд фермент ба субстратын хооронд ковалент холбоо үүсэхийг шаарддаг.PDPL-ийг бусад уургийн цогцолбор, ферментийн гэр бүл, тухайлбал деубикитиназа, металлопротеазын гэр бүлүүдийг судлахад өргөтгөж болно гэж бид найдаж байна.
SOPP3 хэмээх miniSOG-ийн шинэ хэлбэр нь хүчилтөрөгчийн үйлдвэрлэлийг сайжруулсан.Бид miniSOG-г SOPP3-тай харьцуулж, дохио-дуу чимээний харьцаа өөрчлөгдөөгүй хэвээр байгаа хэдий ч тэмдэглэгээний гүйцэтгэл сайжирсан (Нэмэлт зураг 11).Бид SOPP3-ийн оновчлол (жишээ нь, чиглэсэн хувьсал) нь илүү үр дүнтэй гэрэл мэдрэмтгий уургийг бий болгож, гэрлийн хугацааг богиносгож, эсийн илүү динамик процессыг авах боломжийг олгоно гэж бид таамаглаж байсан.PDPL-ийн одоогийн хувилбар нь цэнхэр гэрлийн гэрэлтүүлэг шаарддаг тул эд эсийн гүнд нэвтэрч чадахгүй тул эсийн орчинд хязгаарлагддаг.Энэ онцлог нь амьтны загвар судалгаанд ашиглахыг хориглодог.Гэсэн хэдий ч оптогенетикийг PDPL-тэй хослуулах нь амьтны, ялангуяа тархинд судалгаа хийх боломжийг олгодог.Нэмж дурдахад бусад инженерийн хэт улаан туяаны гэрэл мэдрэмтгий бодисууд нь энэ хязгаарлалтыг арилгадаг.Одоогоор энэ чиглэлээр судалгаа хийж байна.
HEK293T эсийн шугамыг ATCC (CRL-3216) -аас авсан.Эсийн шугамд микоплазмын халдвар илрүүлэх шинжилгээ нь сөрөг гарсан бөгөөд DMEM (Thermo, #C11995500BT) 10%-ийн ургийн үхрийн ийлдэс (FBS, Vistech, #SE100-B) болон 1%-ийн пенициллин/стрептомицин (Hyclone, #SV30010) агуулсан өсгөвөрлөгдсөн.-д өссөн.
Bidepharm-аас 3-Аминофенилен (3-р дээж) ба (4-этинилфенил)метанамин (4-р дээж) худалдаж авсан.Пропиламин (зонд 2)-ийг Energy-chemicals-аас худалдаж авсан.N-(2-Аминофенил)пент-4-намид (датчик 1)-ийг нийтэлсэн аргуудын дагуу нэгтгэсэн.
Нэмэлт Хүснэгт 1-д энэхүү судалгаанд ашигласан генетикийн бүтцийг жагсаав.miniSOG болон KillerRed дарааллыг П.Зугийн (Бээкингийн их сургууль) бэлэглэсэн плазмидаас хувилсан.Митохондрийн матрицын зорилтот дарааллыг COX4-ийн 23 N-терминал амин хүчлээс гаргаж авсан бөгөөд Гибсоны угсралтыг (Beyotime, #D7010S) ашиглан заасан векторууд болгон хуваасан.Эндоплазмын торлогийн мембран ба цөмд чиглүүлэхийн тулд HEK293T эсийн cDNA номын сангаас ПГУ-аар олшруулсан SEC61B хүний ​​ДНХ (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) ба H2B ДНХ (Шэньжэнь Бэй лабораторийн Д. Лин хандивласан) дээр дурдсанчлан хувилсан.Өөрөөр заагаагүй бол шилжүүлэн суулгах болон тогтвортой эсийн шугам барихад ашигласан бусад уургийн генүүдийг HEK293T эсийн cDNA номын сангаас ПГУ-аар олшруулсан.G3S (GGGS) ба G4S (GGGGS) нь өгөөшний уураг болон miniSOG хооронд холбогч болгон ашигласан.Эдгээр хайлуулах бүтцэд V5 эпитопын шошго (GKPIPNPLLGLDST) нэмэгдсэн.Хөхтөн амьтдад илэрхийлэх, тогтвортой эсийн шугамыг бий болгохын тулд miniSOG хайлуулах бүтцийг pLX304 lentiviral вектор руу дэд клоноор хийсэн.Бактерийн илрэлийн хувьд miniSOG-ийг C төгсгөлд 6xHis гэсэн шошготой pET21a вектор болгон хуваасан.
HEK293T эсийг 2.0 х 105 эсээр 6 цооногийн ялтанд суулгаж, 24 цагийн дараа рекомбинант лентивирусын плазмид (2.4 мкг pLX304) болон вирусын савлагааны плазмид (1.5 мкг psPAX2 ба 1.2 мкг pMD02.002 цаг) ашиглан трансфекцийг хийсэн. , #C0533), 80% орчим хайлуулах.Шөнийн турш шилжүүлэн суулгасны дараа орчинг сольж, дахин 24 цагийн турш өсгөвөрлөнө.Вирусыг цуглуулах ажлыг 24, 48, 72 цагийн дараа хийсэн.Зорилтот эсийн шугамыг халдварлахаас өмнө вирусын орчинг 0.8 мкм шүүлтүүрээр шүүж (Merck, #millex-GP) ба полибрен (Solarbio, #H8761) 8 мкг/мл-ийн концентрацид нэмсэн.24 цагийн дараа орчинг өөрчилснөөр эсүүд сэргээгдэхийг зөвшөөрөв.Эхний гурван хэсэгт 5 мкг/мл бластицидин (Solarbio, №3513-03-9) ашиглан эсүүдийг сонгосон.Дараа нь 20 мкг/мл-ийг дараагийн гурван хэсэгт илүү хатуу дэглэм болгон ашигласан.
Нэг нүхэнд ойролцоогоор 20,000 эсийн нягттай эсүүдийг 12 цооногтой камерт (Ibidi, №81201) суулгасан.HEK293T эсийн наалдацыг сайжруулахын тулд 50 мкг/мл фибронектин (Корнинг, №356008) 37 хэмд фосфатын буфержүүлсэн давсны уусмалд (PBS, Sangon, # B640435) шингэлнэ.Тасалгаануудыг 1 цагийн турш урьдчилан боловсруулж, дараа нь PBS-ээр зайлуулсан.24 цагийн дараа эсүүдийг PBS-ээр нэг удаа угааж, Hanks-ийн шинэхэн давсны уусмалд (HBSS, Gibco, №14025092) 1 мМ проб 3-аар 37°С-т 1 цагийн турш өсгөвөрлөж, дараа нь цэнхэр LED (460 нм)-ээр өсгөвөрлөсөн. ).) тасалгааны температурт 10 минутын турш цацрагаар цацсан.Үүний дараа эсүүдийг PBS-ээр хоёр удаа угааж, PBS (Sangon, # E672002) дахь 4% формальдегидээр тасалгааны температурт 15 минутын турш бэхэлсэн.Илүүдэл формальдегидийг тогтсон эсүүдээс гурван удаа PBS-ээр угааж цэвэрлэв.Дараа нь эсүүдийг PBS-д 0.5% Triton X-100 (Sangon, # A600198) нэвчиж, PBS-ээр 3 удаа угаана.Дараа нь камерыг аваад дээж бүрт 50 мкМ Cy3-азид (Аладдин, #C196720), 2 мм CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 мм BTTAA (Confluore, #BDJ-4) агуулсан 25 мкл товшилтын урвалын хольц нэмнэ. ба 0.5 мг/мл натрийн аскорбат (Аладдин, № S105024) ба тасалгааны температурт 30 минутын турш өсгөвөрлөнө.Гэнэтийн урвалын дараа эсийг 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) агуулсан PBS-ээр зургаан удаа угааж, дараа нь PBST дахь 5% BSA (Abcone, #B24726) -аар тасалгааны температурт 30 минутын турш блоклосон.
Хамтарсан дархлаажуулалтын хувьд эсийг заасан нөхцлийн дагуу анхдагч эсрэгбиемүүдээр өсгөвөрлөсөн: хулганы эсрэг V5 шошго mAb (1:500, CST, #80076), туулайн эсрэг Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), туулайн поликлональ калнексины эсрэг эсрэгбие (1:500, Abcam, #ab22595) эсвэл туулайн эсрэг ламины A/C моноклон эсрэгбие (1:500; CST, #2032) 4 °C-т шөнийн турш.PBST-ээр 3 удаа угаасны дараа эсийг хоёрдогч эсрэгбиемээр өсгөвөрлөсөн: ямааны эсрэг туулайн Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) 1:1000, ямааны эсрэг Alexa Fluor 594 (CST, #8889) 1:0000 харьцаагаар шингэлнэ.шингэлэх Өрөөний температурт 30 минутын турш шингэлнэ.Дараа нь эсүүдийг PBST-ээр 3 удаа угааж, өрөөний температурт 10 минутын турш PBS-д DAPI (Thermo, # D1306) -аар будсан.PBS-тэй 3 удаа угаалга хийсний дараа эсүүдийг зураг авахын тулд PBS-д 50% глицерин (Sangon, #A600232) хийж битүүмжилсэн.ZEISS LSM 900 Airyscan2 төвлөрсөн микроскоп болон ZNE 3.5 программ хангамж ашиглан иммунофлуоресцент зургийг авсан.
Ганц хүчилтөрөгчийн флюресцент дүрслэлийн хувьд Hanks HEPES буферт 100 нМ Si-DMA нэмэхийн өмнө эсүүдийг Hanks HEPES буферээр хоёр удаа угаасан (DOJINDO, #MT05).Гэрэлд өртсөний дараа эсүүдийг 37°С-т СО2 инкубаторт 45 минутын турш өсгөвөрлөсөн.Дараа нь эсүүдийг Hanks-ийн HEPES буферээр хоёр удаа угааж, өрөөний температурт 10 минутын турш Hanks-ийн HEPES буферт Hoechst-ээр будаж, ZEISS LSM 900 конфокал микроскопоор дүрсэлсэн., #M36008) кальци, магни агуулсан HBSS буферт.Гэрэл эсвэл доксорубицин (MCE, #HY-15142A)-д өртсөний дараа эсүүдийг CO2-ийн инкубаторт 37°С-т 10 минутын турш өсгөвөрлөж, HBSS буферээр хоёр удаа угааж, Hoechst-тай HBSS буферт тасалгааны температурт өсгөвөрлөсөн.минут.Доксорубициныг эерэг мэдрэгч болгон ашиглаж, эсийг 1% BSA агуулсан HBSS-д 20 мкм доксорубицинээр 30 минутын турш эмчилсэн.Immunfluorescent зургийг Zeiss LSM 900 конфокаль микроскоп ашиглан авсан.
Мито-miniSOG-ийг тогтвортой илэрхийлдэг HEK293T эсийг 15 см-ийн аяганд ойролцоогоор 30%-ийн нягтаар суулгасан.48 цагийн дараа ~80%-ийн нийлбэрт хүрсэн үед эсүүдийг PBS-ээр нэг удаа угааж, шинэ HBSS буферт 1 мМ Probe 3-аар 37°С-т 1 цагийн турш өсгөвөрлөсний дараа өрөөнд цэнхэр LED-ээр 10 минутын турш гэрэлтүүлэв. температур..Үүний дараа эсүүдийг PBS-ээр хоёр удаа угааж, хусаад EDTA агуулаагүй протеазын дарангуйлагч (MCE, #HY-K0011) агуулсан мөс шиг хүйтэн PBS буферт дахин түдгэлзүүлсэн.Үзүүрийг 1 минутын турш (35%-ийн далайцтай 1 секунд асаалттай, 1 секунд унтарсан) дууны долгионы тусламжтайгаар эсүүдийг задалсан.Үр хольцыг хог хаягдлыг арилгахын тулд 15,871 xg-д 10 минутын турш 4 ° C-т центрифуг хийж, BCA уургийн шинжилгээний иж бүрдэл (Beyotime, # P0009) ашиглан дээд давхаргын концентрацийг 4 мг/мл болгон тохируулсан.Дээрх 1 мл лизатыг 0.1 мм фото задралтай биотин азид (Конфлюор, # BBBD-14), 1 мм TCEP (Sangon, # A600974), 0.1 мм TBTA лиганд (Аладдин, # T162437), 1 м SO4 incuM-тэй холбоно. өрөөний температурт 1 цагийн турш эргүүлнэ.Гэнэтийн урвалын дараа хольцыг 10 мл-ийн шилэн саванд урьдчилан хольсон уусмалд (MeOH: CHCl3: H2O = 4 мл: 1 мл: 3 мл) нэмнэ.Дээжүүдийг хольж, тасалгааны температурт 4500 г-т 10 минутын турш центрифуг хийсэн.Доод ба дээд уусмалыг хаяж, тунадасыг 1 мл метанолоор хоёр удаа угааж, 15871 × г-т 40С-т 5 минутын турш центрифуг хийв.Тунадасыг уусгахын тулд 25 мМ аммонийн бикарбонат (ABC, Aladdin, № A110539) -д 1 мл 8 М мочевин (Аладдин, № U111902) нэмнэ.Дээжийг 10 мм дитиотреитолоор (Sangon, # A100281 25 мм ABC-д) 55 ° C-т 40 минутын турш сэргээж, дараа нь харанхуйд тасалгааны температурт 15 мм шинэ иодоацетамид (Sangon, # A600539) нэмсэн.30 минутын дотор алкилизаци хийнэ..Урвалыг зогсоохын тулд нэмэлт 5 мм дитиотреитол нэмсэн.Дээж тус бүрт ойролцоогоор 100 мкл NeutrAvidin агарозын ирмэгийг (Thermo, №29202) 1 мл PBS-ээр 3 удаа угаана.Дээрх протеомын уусмалыг 5 мл PBS-ээр шингэлж, урьдчилан угаасан NeutrAvidin агарозын ирмэгээр тасалгааны температурт 4 цагийн турш өсгөвөрлөнө.Дараа нь бөмбөлгүүдийг 0.2% SDS (Sangon, #A600485) агуулсан 5 мл PBS-ээр 3 удаа, 1М мочевин агуулсан 5 мл PBS-ээр 3 удаа, 5 мл ddH2O-ээр 3 удаа угаана.Дараа нь бөмбөлгүүдийг центрифугийн аргаар хурааж аваад 1 М мочевин, 1 мМ CaCl 2 (Macklin, # C805228) болон 20 нг/мкл трипсин (Promega, # V5280) агуулсан 200 мкл 25 мм ABC-д дахин түдгэлзүүлсэн.Эргүүлснээр 37°С-т шөнийн турш трипсинизаци хийнэ.РН 2-3 хүрэх хүртэл шоргоолжны хүчил (Thermo, # A117-50) нэмснээр урвалыг зогсоосон.Бөмбөлгүүдийг 0.2% SDS агуулсан 1 мл PBS-ээр 3 удаа, 1 М мочевин агуулсан 1 мл PBS-ээр 3 удаа, дараа нь 1 мл нэрмэл усаар 3 удаа угаана.Өөрчлөгдсөн пептидүүдийг 200 мкл 70% MeOH ашиглан 90 минутын турш хөнгөн задралаар (365 нм) гаргасан.Центрифугийн дараа дээд давхаргыг цуглуулсан.Дараа нь бөмбөлгүүдийг нэг удаа 100 мкл 70% MeOH-ээр угааж, дээд давхаргыг нэгтгэв.Дээжийг Speedvac вакуум баяжуулах төхөөрөмжид хатааж, шинжилгээ хийх хүртэл -20 хэмд хадгалсан.
Синглет хүчилтөрөгчөөр өөрчлөгдсөн пептидийг тодорхойлох, хэмжихийн тулд дээжийг 0.1% шоргоолжны хүчилд дахин уусгаж, 1 мкг пептидүүдийг Tune-ийн нано ESI эх үүсвэрээр тоноглогдсон Orbitrap Fusion Lumos Tribrid масс спектрометр, борлуулагчийн 4.3 програм хангамжийн Xcalibur ашиглан шинжлэв.Дээжийг 3 μм C18 материалаар (ReproSil-pur, #r13.b9.) 75 μm × 15 см хэмжээтэй, дотроо савласан капилляр багана дээр салгаж, EASY-nLC 1200 UHPLC системд (Thermo) холбосон.Пептидүүдийг шугаман 95 минутын градиент хроматографийн аргаар 8%-ийн уусгагч В-ээс 50%-ийн уусгагч В хүртэл салгасан (A = 0.1% усан дахь шоргоолжны хүчил, В = 80% ацетонитрилд 0.1% шоргоолжны хүчил), дараа нь B мин 98% хүртэл шугаман нэмэгдүүлсэн. 6 минутын дотор 300 нл/мин урсгалын хурдаар.Orbitrap Fusion Lumos нь өгөгдлөөс хамааран бүрэн MS скан болон MS2 сканнерын хооронд ээлжлэн мэдээлэл цуглуулдаг.Шүрших хүчдэлийг 2.1 кВ-т тохируулсан бөгөөд ион тээвэрлэх хялгасан судасны температур 320 ° C байв.MS спектрийг (350-2000 м/ц) 120,000, AGC 4 × 105, хамгийн ихдээ 150 мс-ийн оролтын хугацаатай цуглуулсан.Бүрэн скан бүр дэх хамгийн түгээмэл 10 үржүүлэгч цэнэглэгдсэн прекурсоруудыг HCD ашиглан 30% -ийн мөргөлдөөний хэвийн энергитэй, 1.6 м/ц дөрвөлжин тусгаарлагч цонхтой, 30,000 нягтралтайгаар хуваасан.5×104 ба хамгийн их оролтын хугацаа 150 мс-ийг ашиглан тандем масс спектрометрийн AGC зорилтот.Динамик онцгой тохиолдлыг 30 секунд гэж тохируулсан. Оноологдоогүй ионууд эсвэл 1+ ба >7+ цэнэгтэй ионуудыг MS/MS-ийн хувьд татгалзсан. Оноологдоогүй ионууд эсвэл 1+ ба >7+ цэнэгтэй ионуудыг MS/MS-ийн хувьд татгалзсан. Неназначенные ионы эсвэл ионы с зарядом 1+ ба >7+ нь МС/МС-д зориулагдсан. MS/MS-д хуваарилагдаагүй ионууд эсвэл 1+ ба >7+ цэнэгтэй ионууд татгалзсан.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ион эсвэл ионы с зарядами 1+ ба >7+ нь МС/МС-д зориулагдсан. Тодорхойлогдоогүй ионууд эсвэл 1+ ба >7+ цэнэгтэй ионууд MS/MS-ийн хувьд татгалзсан.
Түүхий өгөгдлийг MSFragger дээр суурилсан FragPipe тооцоолох платформ ашиглан боловсруулдаг.Массын хазайлт ба холбогдох амин хүчлүүдийг задгай хайлтын алгоритм ашиглан -150-аас 500 Да хүртэлх прекурсорын массын хүлцэлтэй тодорхойлсон.Дараа нь өөрчлөгдсөн пептидүүдийг гистидиний өөрчлөлтийг ашиглан PD дахь массын өсөлт +229.0964 ба +247.1069 Да (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) тодорхойлсон.
Нийлсэн miniSOG генийг тогтвортой илэрхийлдэг эсүүдийг 6 см хэмжээтэй аяганд хийсэн.~80%-д хүрэхэд эсүүдийг HBSS (Gibco, #14025092)-ээр нэг удаа угааж, дараа нь HBSS-д химийн датчикаар 37°С-т 1 цагийн турш өсгөвөрлөж, цэнхэр гэрлээр гэрэлтүүлэв.Өрөөний температурт 20 минутын турш 10 Вт LED.PDPL-д ямар төрлийн реактив хүчилтөрөгч оролцож байгааг тодорхойлохын тулд 0.5 мм витамин С (MCE, #HY-B0166), 5 ммМ Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , Нэмэлт болгон эсүүдэд 100 мм маннитол (Эрчим хүчний химийн бодис, №69-65-8), 100 мкМ H2O2, 10 мМ NaN3 нэмсэн.Хүйтэн PBS-ээр угаасны дараа эсийг хусаж, 1.5 мл центрифугийн хоолойд цуглуулж, EDTA агуулаагүй 1x протеазын дарангуйлагчтай 200 мкл PBS-д 1 минутын турш үзүүрээр дуу авианы долгионы нөлөөлөл (1 секунд, 1 секунд байхгүй, далайц 35%).Үүссэн хольцыг 15,871 × г-т 4 0С-т 10 минутын турш центрифуг хийж, BCA уургийн шинжилгээний иж бүрдэл ашиглан дээд давхаргын концентрацийг 1 мг/мл болгон тохируулсан.Дээрх лизатаас ойролцоогоор 50 мкл-ийг 0.1 мМ родамин азид (Аладдин, № T131368), 1 мм TCEP, 0.1 мм TBTA лиганд, 1 мм CuSO4-т 1 цагийн турш тасалгааны температурт доороос дээш эргүүлж өсгөвөрлөсөн.Товших урвалын дараа дээжүүдэд 250 мкл урьдчилан хөргөсөн ацетон нэмж, -20°С-т 20 минут өсгөвөрлөж, 6010хг-т 4°С-т 10 минутын турш центрифуг хийх замаар ацетоноор тунадасжуулах ажлыг гүйцэтгэв.Үрлэнг цуглуулж, 50 мкл 1x Laemmli буферт 95 0С-т 10 минут буцалгана.Дараа нь дээжийг SDS-PAGE урт гель дээр шинжилж, Image Lab Touch программ хангамж бүхий Bio-rad ChemiDoc MP Touch дүрслэлийн системийг ашиглан дүрсэлсэн.
Рекомбинант miniSOG-6xHis уургийг илэрхийлэх, цэвэршүүлэх ажлыг өмнө тайлбарласны дагуу гүйцэтгэсэн.Товчхондоо, E. coli BL21(DE3) эсийг (TransGen, # CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis-ээр хувиргаж, уургийн илэрхийлэлийг 0.5 мМ IPTG (Sangon, # A600168) -аар үүсгэсэн.Эсийн задралын дараа уурагуудыг Ni-NTA агароз бөмбөлгүүдийг (MCE, № 70666) ашиглан цэвэршүүлж, PBS-ийн эсрэг диализ хийж, -80 ° C-д хадгалсан.
Эсрэгбие дээр суурилсан in vitro шошгонд ойртох шинжилгээний хувьд 100 мкМ цэвэршүүлсэн miniSOG, 1 мМ датчик 3, 1 мкг шошгын эсрэг хулганы моноклон эсрэгбие (TransGen, #HT501-01)-ийг PBS-д нийт 50 мкл урвалын эзэлхүүнтэй холино..Урвалын хольцыг тасалгааны температурт 0, 2, 5, 10, 20 минутын турш цэнхэр LED гэрлээр цацруулсан.Холимогийг 0.1 мм биотин-ПЕГ3-азид (Аладдин, # B122225), 1 мм TCEP, 0.1 мм TBTA лиганд, 1 мм CuSO4-тэй хамт тасалгааны температурт дээш чиглэсэн сэгсрэгч дээр 1 цагийн турш өсгөвөрлөсөн.Гэнэтийн урвалын дараа 4x Laemmli-ийн буферийг хольц руу шууд нэмээд 95°С-т 10 минут буцалгана.Дээжийг SDS-PAGE гель дээр шинжилж, стрептавидин-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) бүхий western blotting-ээр шинжлэв.
С-терминал амидац (LHDALDAK-CONH2) бүхий гистидин агуулсан синтетик пептидийг ойролцоох пептид дээр суурилсан in vitro шошгон дээр шинжлэхэд ашигласан.Энэхүү шинжилгээнд 100 μМ цэвэршүүлсэн miniSOG, 10 mM датчик 3 ба 2 мкг/мл синтетик пептидийг PBS-д 50 мкл-ийн нийт урвалын эзэлхүүнтэй хольсон.Урвалын хольцыг тасалгааны температурт 1 цагийн турш цэнхэр LED гэрлээр цацруулсан.Нэг микролитр дээжийг LC-MS систем (Waters, MassLynx спектрийн шинжилгээний программтай SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight масс спектрометр) ашиглан шинжилсэн.
MiniSOG хайлуулах генийг тогтвортой илэрхийлдэг HEK293T эсийг өөр өөр эрхтэний байршилтай шугамд (Mito, ER, Nucleus) 10 см-ийн аяганд, Parkin-miniSOG болон BRD4-miniSOG шугамын хувьд 15 см-ийн аяганд суулгасан.~90%-д хүрэхэд эсүүдийг HBSS-ээр нэг удаа угааж, дараа нь HBSS-д 37°C-т 1 цагийн турш датчик 3-аар өсгөвөрлөж, өрөөний температурт 10 Вт цэнхэр LED-ээр гэрэлтүүлэв.Паркиныг контактгүй шошгонд оруулахын тулд HBSS дахь датчик 3-тай 10 мкМ протон карбонил цианидын зөөгч m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) 37°C-т 1 цагийн турш нэмсэн.Эсийн задрал, товшилтын хими, багасгах, алкилжих үе шатууд нь дээр дурдсантай ижил байсан бөгөөд зөвхөн 2 мг лизат нэмж, фото задрах биотин азидын оронд биотин PEG3 азидыг товших урвалд ашигласан.Баяжуулсны дараа бөмбөлгүүдийг 0.2% SDS агуулсан 5 мл PBS-ээр 3 удаа, 1 М мочевин агуулсан 5 мл PBS-ээр 3 удаа, 5 мл PBS-ээр 3 удаа угаана.Дараа нь 1 м мочевин агуулсан 300 мкл 25 мм ABC-д 2 мкг трипсин нэмээд 37 градусын температурт уургийг нэг шөнийн дотор задлав.рН 2-3 хүрэх хүртэл шоргоолжны хүчил нэмж урвалыг зогсоосон.Бөмбөлгүүдийг дээр трипсинжүүлсний дараа пептидийн уусмалыг SOLAµ HRP багана (Термо, №60209-001) ашиглан давсгүйжүүлж, Speedvac вакуум баяжуулах төхөөрөмжид хатаана.Пептидүүдийг 0.1%-ийн шоргоолжны хүчилд дахин уусгаж, дээр дурдсан нано-ESI эх үүсвэрээр тоноглогдсон Orbitrap Fusion Lumos Tribrid масс спектрометрийг ашиглан 500 нг пептидүүдийг шинжлэв.Арилжааны RP-HPLC багана (75 мкм х 2 см) (Термо, дугаар 164946) болон аналитик RP-HPLC багана (75 мкм x 25 см) (Термо, дугаар 164941) дээр пептидүүдийг салгаж, хоёуланг нь 2 мкм-ээр дүүргэсэн.градиент 8%-аас 35% ACN 60 минутын дотор, дараа нь 300 Нл/мин урсгалын хурдаар 6 минутын дотор 98% B хүртэл шугаман өсөлт.MS спектрийг (350-1500 м/ц) 60,000 нарийвчлалтай, AGC 4 × 105, хамгийн ихдээ 50 мс оруулах хугацаатай цуглуулсан.Сонгосон ионуудыг HCD-ээр 3 сек циклээр дараалан хуваасан мөргөлдөөний хэвийн энерги 30%, дөрвөлсөн туйл тусгаарлах цонх 1.6 м/ц, 15000 нягтралтай. 5 × 104 тандем масс спектрометрийн AGC зорилт ба тарилгын хамгийн их хугацаа. 22 мс ашигласан.Динамик хасалтыг 45 секунд гэж тохируулсан. Оноологдоогүй ионууд эсвэл 1+ ба >7+ цэнэгтэй ионуудыг MS/MS-ийн хувьд татгалзсан. Оноологдоогүй ионууд эсвэл 1+ ба >7+ цэнэгтэй ионуудыг MS/MS-ийн хувьд татгалзсан. Неназначенные ионы эсвэл ионы с зарядом 1+ ба >7+ нь МС/МС-д зориулагдсан. MS/MS-д хуваарилагдаагүй ионууд эсвэл 1+ ба >7+ цэнэгтэй ионууд татгалзсан.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ион эсвэл ионы с зарядами 1+ ба >7+ нь МС/МС-д зориулагдсан. Тодорхойлогдоогүй ионууд эсвэл 1+ ба >7+ цэнэгтэй ионууд MS/MS-ийн хувьд татгалзсан.
NeutrAvidin бөмбөлгүүдийг баяжуулах хүртэлх дээж бэлтгэх үе шат нь дээр дурдсан LC-MS/MS шинжилгээтэй ижил байсан.Ойролцоогоор 50 мкг лизатыг ачааллыг хянахад, 2 мг лизатыг товших урвалд ашигласан.Нейтравидинаар баяжуулж, угаасны дараа холбосон уургуудыг агарозын давирхайн бөмбөлгүүдэд 50 мкл Лаэммли буфер нэмж, 95 ° C-т 5 минут буцалгана.Хяналтын ачааллын оролт болон ирмэгээр баяжуулсан дээжийг SDS-PAGE-ээр шинжилж, стандарт Western blot аргаар PVDF мембран (Millipore, #ISEQ00010) руу шилжүүлэв.Мембраныг 0.1% tween-20 (TBST) агуулсан TBS дахь 5% тосгүй сүүгээр (Sangon, #A600669) хааж, анхдагч болон хоёрдогч эсрэгбиемүүдээр дараалан өсгөвөрлөсөн.Анхан шатны эсрэгбиемүүдийг TBST-д 5%-ийн тосгүй сүүнд 1:1000 харьцаагаар шингэлж, 4°С-т шөнийн турш өсгөвөрлөнө.Хоёрдогч эсрэгбиемүүдийг 1:5000 харьцаагаар хэрэглэж, тасалгааны температурт 1 цагийн турш өсгөвөрлөнө.Мембрануудыг Chemidoc MP дүрслэлийн системийг ашиглан химилюминесценцээр дүрсэлсэн.Зураг дээрх толбо болон гелийн хайчлаагүй бүх сканнеруудыг түүхий өгөгдөл болгон үзүүлэв.
Энэхүү судалгаанд ашигласан үндсэн эсрэгбиемүүдэд туулайн эсрэг SFPQ моноклон эсрэгбие (CST, № 71992), туулайн эсрэг FUS моноклон эсрэгбие (CST, № 67840), туулайн эсрэг NSUN2 поликлональ эсрэгбие (Proteintech, № 20854-1-) орсон. AP), туулайн эсрэг mSin3A поликлональ эсрэгбие (Abcam, #ab3479), хулганы шошгын эсрэг моноклон эсрэгбие (TransGen, #HT201-02), хулганы эсрэг β-актин моноклональ эсрэгбие (TransGen, #HC201-01), туулайн эсрэг -CDK2 моноклональ эсрэгбие (ABclonal, #A0094), CTBP1-ийн туулайн моноклональ эсрэгбие (ABclonal, #A11600), DUT-ийн туулайн поликлональ эсрэгбие (ABclonal, #A2901), туулайн поликлональ эсрэгбие нь DUT-д (ABclonal, #A2901), туулайн поликлональ эсрэгбие нь PSMC4 (ABclonal, #A0094), DNAJB1 поликлональ эсрэгбие (ABclonal, # A5504).Эдгээр эсрэгбиемүүдийг TBST дахь 5%-ийн тослоггүй сүүнд 1:1000 шингэрүүлэлтээр ашигласан.Энэхүү судалгаанд ашигласан хоёрдогч эсрэгбиемүүдэд туулайн эсрэг IgG (TransGen, #HS101-01), хулганы эсрэг IgG (TransGen, #HS201-01) 1:5000 шингэрүүлэлтээр хийгдсэн.
BRD4 нь SFPQ-тай харилцан үйлчлэлцэж байгаа эсэхийг цаашид судлахын тулд HEK293T-ийг хэт их илэрхийлдэг тогтвортой HEK293T болон BRD4-miniSOG эсүүдийг 10 см хэмжээтэй аяганд хийсэн.Эсүүдийг хүйтэн PBS-ээр угааж, EDTA агуулаагүй протеазын дарангуйлагчтай 1 мл Пирс IP лизисын буферт (Термо Фишер, №87787) 40С-т 30 минутын турш задалсан.Үүний дараа лизатуудыг 1.5 мл центрифугийн хоолойд цуглуулж, 4°С-т 10 минутын турш 15,871 xg-т центрифуг хийв.Супернатантыг хураан авч, 5 мкг анти-V5 шошготой хулганы моноклон эсрэгбие (CST, №80076) -аар 4°С-т шөнийн турш өсгөвөрлөсөн.Ойролцоогоор 50 мкл уургийн A/G соронзон хальсыг (MCE, #HY-K0202) 0.5% Tween-20 агуулсан PBS-ээр хоёр удаа угаана.Дараа нь эсийн лизатуудыг соронзон бөмбөлгүүдийгээр 4 цагийн турш 40С-т доороос дээш эргүүлэх замаар өсгөвөрлөнө.Дараа нь бөмбөлгүүдийг 1 мл PBST буферээр дөрвөн удаа угааж, 95 градусын температурт 5 минут буцалгана.Дээжийг SDS-PAGE гель дээр шинжилж, стандарт Western blot аргыг ашиглан PVDF мембран руу шилжүүлэв.Мембраныг TBST дахь 5% тосгүй сүүнд хийж, анхдагч болон хоёрдогч эсрэгбиемүүдээр дараалан өсгөвөрлөнө.Primary Antibody Rabbit anti-SFPQ моноклональ эсрэгбиеийг (CST, #71992) TBST дэх 5%-ийн тосгүй сүүнд 1:1000 харьцаатай хэрэглэж, 4°С-т шөнийн турш өсгөвөрлөсөн.Туулайн эсрэг IgG-ийг 1:5000 харьцаагаар хэрэглэж, тасалгааны температурт 1 цагийн турш өсгөвөрлөнө.Мембрануудыг Chemidoc MP дүрслэлийн системийг ашиглан химилюминесценцээр дүрсэлсэн.
Уусгагч хүртээмжтэй гадаргуугийн талбайн (SASA) шинжилгээнд ашигласан бүх бүтцийг Уургийн мэдээллийн сан (PDB)52 эсвэл AlphaFold уургийн бүтцийн мэдээллийн сангаас53 авсан.Үнэмлэхүй SASA-г FreeSASA програмыг ашиглан үлдэгдэл тус бүрээр тооцсон.Бүтэц тус бүрийн дундаж SASA-г авахын тулд зөвхөн шошготой гистидин болон түүний хөршүүдийн бүрэн бөгөөд хоёрдмол утгагүй SASA өгөгдлийг ашигласан.Гистидин тус бүрийн харьцангуй уусгагч хүртээмжийг (RSA) SASA-ийн үнэмлэхүй утгыг уусгагчийн боломжтой үлдэгдэл гадаргуугийн эмпирик хамгийн их боломжит талбайд хуваах замаар тооцоолсон.Дараа нь RSA дундаж үзүүлэлт 20%-иас доош байвал бүх гистидинийг далд гэж ангилдаг, эс тэгвээс ил гарсан56.
DDA горимд олж авсан түүхий файлуудыг Proteome Discoverer (v2.5) эсвэл MSfragger (Fragpipe v15.0) ашиглан нийтлэг бохирдуулагч агуулсан SwissProt баталгаажуулсан уургийн мэдээллийн санд хайсан.Пептидүүд нь хоёр алга болсон хуваагдал бүхий бүрэн трипсин, тогтмол өөрчлөлтийн хувьд карбамоил метилжилт, динамик өөрчлөлтийн хувьд метионины исэлдэлтийг шаарддаг.Урьдчилсан болон фрагментийн жингийн хүлцлийг тус бүр 10 ppm ба 0.02 Да (MS2 Orbitrap) гэж тохируулсан. Бохирдуулагч бодисыг устгаж, уургуудыг шүүж, хуурамч илрүүлэлтийн хувь хэмжээг <1% гаргав. Бохирдуулагч бодисыг устгаж, уургуудыг шүүж, хуурамч илрүүлэлтийн хувь хэмжээг <1% гаргав. Попадания загрязняющих веществ нь удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Бохирдуулагчийг устгаж, уургуудыг шүүж, худал илрүүлэлтийн хувь <1% байна.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений <1%. Бохирдуулагчийг устгаж, уургуудыг шүүж, <1%-ийн хуурамч эерэг үр дүнд хүрсэн.Шошго ашиглахгүйгээр тоон шинжилгээ хийхийн тулд биологийн гурван давталтын уургийн хэвийн агууламжийг ашигласан.Уургийн дэд эсийн локалчлалын шинжилгээг DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 болон Алис Тинг группээс эмхэтгэн нийтэлсэн мэдээллийн сангаас Gene Ontology (GO) шинжилгээг ашиглан хийсэн.Галт уулын газрын зургийг Персеусаас авсан (v1.6.15.0). Уургийн элбэг дэлбэг байдлын өөрчлөлтийг хоёр талт t-тест ашиглан статистикийн ач холбогдлыг шалгасан бөгөөд уургийн цохилтыг элбэг дэлбэг байдлын өөрчлөлт >2 (өөрөөр заагаагүй бол) болон p утга <0.05 гэж тодорхойлсон. Уургийн элбэг дэлбэг байдлын өөрчлөлтийг хоёр талт t-тест ашиглан статистикийн ач холбогдлыг шалгасан бөгөөд уургийн цохилтыг элбэг дэлбэг байдлын өөрчлөлт >2 (өөрөөр заагаагүй бол) болон p утга <0.05 гэж тодорхойлсон. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с ашиглах хоёр t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (эсли не указано иное) болон х <0, p <0,. Уургийн агуулгын атираа өөрчлөлтийг хоёр сүүлт t-тест ашиглан статистикийн ач холбогдлыг шалгасан бөгөөд уургийн таарч агуулгын өөрчлөлт >2 (өөрөөр заагаагүй бол) болон AP утга <0.05 байна.使用 双边 t 检验 检验 蛋白质 丰度 倍数 倍数 的 的 的 显着性 统计 蛋白质 命 中 命 中 中 中 中> 2 (除非 说明 变化) 和 变化 命 中 变化 和 变化 和 (有 说明) 和 变化 中> 2 (除非 说明) 和 中 变化> 2 (除非 说明 变化) 和 变化 变化 变化 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 值 <0.05 байна.使用 使用 T 双边 T 检验 测试 倍 倍 数 数 的 的 显着性 并 确定 命 命 命 命 中 中 (另 丰度) 和 中 中 (另 丰度) 和 命 中 变化 和 和 和 (另 说明 变化) 和 中 中 变化 和 (另 说明) 和 中 变化 和 (另 说明) 和 中 丰度 变化 (另 说明) 和 丰度 变化 和 变化 和 (另 说明) 和 丰度 变化 和 (另 说明) 和 中 和 变化 和 和 (另 说明 变化 和 和 和 和 和 和 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (эсли не указано иное) болон p-значений <0,05. Уургийн агууламж дахь нугалах өөрчлөлтийн статистик ач холбогдлыг хоёр сүүлт t-тест ашиглан туршсан ба агуулгын өөрчлөлт >2 (өөр заагаагүй бол) ба p-утга <0.05 байвал уургийн тохирлыг тодорхойлсон.Уургийн харилцан үйлчлэлийн шинжилгээг String мэдээллийн сангийн хамт GO шинжилгээг ашиглан хийсэн.
Биологийн гурван давталт хийсэн ижил төстэй үр дүн гарсан.Статистикийн шинжилгээг GraphPad Prism (GraphPad програм хангамж) ашиглан хийсэн ба галт уулын талбайг Perseus (v1.6.15.0) ашиглан үүсгэсэн.Хоёр бүлгийг харьцуулахын тулд хоёр сүүлт Оюутны t-тест ашиглан p-утгыг тодорхойлсон.Туршилтын бүлэгт дор хаяж хоёр удаа тодорхойлсон ганц бие уурагуудыг галт уулын талбайд оруулсан бөгөөд хяналтын бүлгийн харгалзах дутуу утгыг хэвийн тархалтаас Персеусаар сольж, p-утгыг тооцоолох боломжтой болсон.Алдааны мөр нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.Статистикийн шинжилгээнд зориулж протеомик шинжилгээнд дор хаяж хоёр биологийн хуулбарт гарч ирсэн уургийн элбэг дэлбэг байдлыг хадгалсан.Түүврийн хэмжээг урьдчилан тодорхойлохын тулд статистикийн аргыг ашиглаагүй.Туршилтууд санамсаргүй биш юм.Туршилт хийх, үр дүнг үнэлэх явцад судлаачид даалгавруудыг үл тоомсорлосонгүй.
Судалгааны дизайны талаар нэмэлт мэдээлэл авахыг хүсвэл энэ нийтлэлтэй холбосон Байгалийн судалгааны тайлангийн хураангуйг үзнэ үү.
Энэхүү судалгаагаар олж авсан масс спектрометрийн өгөгдлийг PXD034811 (PDPL-MS өгөгдлийн багц) өгөгдлийн багцын дор iProX57 түншийн репозитороор дамжуулан ProteomeXchange Консорциумд илгээсэн.Түүхий өгөгдлийг түүхий өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгдөг.Энэ нийтлэл нь анхны өгөгдлийг өгдөг.
Gngras, AC, Abe, KT & Raught, B. Ойролцоох газартай танилцах нь: уургийн нэгдлүүдийг тодорхойлж, органеллуудын зураглалыг тодорхойлохын тулд ойроос хамааралтай биотинизацийг ашиглах. Gngras, AC, Abe, KT & Raught, B. Ойролцоох газартай танилцах нь: уургийн нэгдлүүдийг тодорхойлж, органеллуудын зураглалыг тодорхойлохын тулд ойроос хамааралтай биотинизацийг ашиглах.Гинграс, AS, Abe, KT болон Raut, B. Хүрээлэн буй орчинтой танилцах: уургийн цогцолборыг тодорхойлох, зураглах органеллуудыг тодорхойлохын тулд ойролцоо байдлаас хамааралтай биотинилжилтийг ашиглах. Гинграс, AC, Abe, KT & Raaught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并。 Gngras, AC, Abe, KT & Raught, B. Хөршийг ойлгох нь: биологийн амьдралаас хөршийн хамаарлыг ашиглах.Gngras, AS, Abe, KT and Raut, B. Ойролцоох нь: уургийн цогцолборын шинж чанар, ойроос хамааралтай биотинилжилтийг ашиглан органеллуудын зураглал.Одоогийн.Миний бодол.Химийн.биологи 48, 44–54 (2019).
Гери, Ж.Б. нар.Декстерийн энергийг дархлааны эсүүдэд шилжүүлэх замаар бичил орчны зураглал.Шинжлэх ухаан 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Хоёр протеомын масштабтай сүлжээ нь хүний ​​интерактомын эсийн өвөрмөц өөрчлөлтийг илрүүлдэг.184, 3022–3040.e3028 нүд (2021).