Мэдээ

Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Энэ хооронд байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг ямар ч загвар, JavaScript-гүйгээр үзүүлэх болно.
Хорт хавдрын эсүүд эсийн стрессийг даван туулахын тулд янз бүрийн механизмыг хөгжүүлж, урагшилсаар байна.Protein kinase R (PKR) ба түүний уургийн идэвхжүүлэгч (PACT) нь эсийн үржил, апоптозыг дарангуйлахад хүргэдэг янз бүрийн стрессийн дохиог хянадаг анхны хариу үйлдэл үзүүлдэг.Гэсэн хэдий ч хорт хавдрын эсүүд дэх PACT-PKR замын зохицуулалт тодорхойгүй хэвээр байна.Эндээс бид урт кодчилдоггүй РНХ (lncRNA) аспартил тРНХ синтетаза антисенс РНХ 1 (DARS-AS1) нь PACT-PKR замыг дарангуйлахад шууд оролцож, хорт хавдрын эсийн өсөлтийг дэмждэг болохыг олж мэдсэн.CRISPRi 971 хорт хавдартай холбоотой lncRNA-ийн том хэмжээний функциональ скринингийг ашиглан бид DARS-AS1 нь хорт хавдрын эсийн өсөлтийг ихээхэн нэмэгдүүлдэг болохыг олж мэдсэн.Тиймээс DARS-AS1-ийн цохилт нь эсийн үржлийг дарангуйлж, янз бүрийн хорт хавдрын эсийн шугам дахь хорт хавдрын эсийн апоптозыг in vitro болгож, хавдрын өсөлтийг in vivo мэдэгдэхүйц бууруулдаг.Механик байдлаар DARS-AS1 нь PACT идэвхжүүлэх домэйнтэй шууд холбогдож, PACT-PKR-ийн харилцан үйлчлэлээс сэргийлж, улмаар PKR идэвхжих, eIF2α фосфоржилтыг бууруулж, апоптозын эсийн үхлийг дарангуйлдаг.Эмнэлзүйн хувьд DARS-AS1 нь олон төрлийн хорт хавдруудад өргөн илэрдэг бөгөөд энэ lncRNA хэт ихэссэн нь таамаглал муу байгааг илтгэнэ.Энэхүү судалгаа нь DARS-AS1 lncRNA-ээр PACT-PKR замын хорт хавдрын өвөрмөц зохицуулалтыг тодруулж, хорт хавдрын прогноз, эмчилгээний өөр нэг зорилтыг өгдөг.
Стресстэй дасан зохицох чадвар нь хорт хавдрын эсийн оршин тогтнох, үржих чухал шинж чанар юм.Хорт хавдрын хурдацтай тархалт ба бодисын солилцооны шинж тэмдгүүд нь шим тэжээлийн дутагдал, гипокси, бага рН зэрэг хатуу бичил орчинд дээд цэгтээ хүрдэг бөгөөд энэ нь эсийн үхлийн дохионы замыг өдөөж болно.Хорт хавдрын үед p535, дулааны цочролын уургууд 6, 7, KRAS8, 9, HIF-110, 11, 12, 13 зэрэг стресст мэдрэмтгий генийн зохицуулалт алдагдах нь хорт хавдрын үед байнга ажиглагддаг бөгөөд ингэснээр апоптозыг хааж, амьд үлдэхийг дэмждэг.
Protein kinase R (PKR) нь чухал стресс мэдрэгч ба эукариот эхлэлийн хүчин зүйл 2α (eIF2α)-ийн дэд нэгж киназ бөгөөд эсийн стрессийг эсийн үхэлд холбодог орчуулагч зохицуулагч юм.PKR нь гадаад давхар судалтай РНХ (dsRNA) илрүүлэх замаар анх вирусын эсрэг уураг болохыг тодорхойлсон.Идэвхжүүлсний дараа PKR нь вирус болон эсийн уургийн нийлэгжилтийг дарангуйлахын тулд eIF2α-г фосфоржуулдаг14,15,16.PACT (PKR идэвхжүүлэгч уураг) нь dsRNA17,18,19,20,21,22,23 байхгүй үед анхны PKR идэвхжүүлэгч уураг болохыг тогтоосон.PKR-тэй шууд харьцах замаар PACT нь янз бүрийн стрессийг (ийлдэсний өлсгөлөн, хэт исэл эсвэл арсенитийн эмчилгээ) PKR болон доод урсгалын дохионы замд шилжүүлдэг.eIF2α фосфоржилтоос гадна PACT-зуучлагдсан PKR идэвхжүүлэлт нь PI3K/Akt24 замаар дамжих исэлдэлтийн төлөвийг өөрчлөх, p5325,26 болон NF-κB27,28-ээр дамжуулан ДНХ-ийн гэмтлийг шалгах, Транскрипцийг зохицуулах, 29 зэрэг стрессийн хариу үйлдэлтэй холбоотой янз бүрийн үйл явдлыг өдөөдөг. Стрессийн хариу урвал, тархалт, апоптоз болон бусад эсийн үндсэн процессуудад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг тул PKR ба PACT нь олон өвчнийг, ялангуяа хорт хавдрын эмчилгээний зорилтыг амлаж байна30,31,32,33.Гэсэн хэдий ч энэхүү плейотроп функциональ болон биологийн ач холбогдлыг үл харгалзан хорт хавдрын эсүүд дэх PACT/PKR-ийн үйл ажиллагааг зохицуулах нь тодорхойгүй хэвээр байна.
lncRNAs нь уураг кодлох чадваргүй 200-аас дээш нуклеотидын хуулбар юм.Бүхэл бүтэн геномын дараалал тогтоох хамгийн сүүлийн үеийн төслүүд олон мянган lncRNA-г илрүүлснээс хойш 35,36 тэдний биологийн функцийг тодруулахын тулд маш их хүчин чармайлт гаргасан.Өсөн нэмэгдэж буй судалгаанаас үзэхэд lncRNA нь биологийн олон процесст оролцдог37, үүнд X-хромосомын идэвхгүйжилт38,39, импринтинг40, транскрипц41,42, орчуулга43, тэр ч байтугай хорт хавдрын өсөлт44,45,46,47 зэрэг орно.Эдгээр судалгаагаар олон lncRNA нь PACT/PKR замд оролцдог гэж мэдээлсэн.Ийм судалгаагаар lncRNA ASPACT нь PACT транскрипцийг дарангуйлж, PACT мРНХ-ийн цөмийн хадгалалтыг нэмэгдүүлснийг харуулсан.Бусад судалгаагаар lncRNA nc886 нь PKR-тэй холбогдож, фосфоржилтыг дарангуйлдаг49,50.Одоогоор PACT-зуучлагдсан PKR идэвхжүүлэлтийг зохицуулдаг lncRNA-г мэдээлээгүй байна.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) нь oncogenic lncRNA51,52,53,54 болох нь тогтоогдсон.miP-194-5p53, miP-12952 болон miP-532-3p51-ийн зохицуулалтаар DARS-AS1 нь тунгалаг эсийн бөөрний хорт хавдар, бамбай булчирхайн хорт хавдар, жижиг эсийн уушгины хорт хавдрын өсөлтийг дэмждэг.Тонг болон түүний хамтрагчид мөн DARS-AS1 нь уураг 39 (RBM39) РНХ-тай холбох мотивийн тогтвортой байдлыг хадгалах замаар миеломагийн явцыг дэмждэг болохыг тогтоожээ.Гэсэн хэдий ч энэхүү lncRNA нь PACT-PKR идэвхжүүлэлт болон хорт хавдрын эсүүдийн стрессийн хариу урвалыг зохицуулахад оролцдог эсэх талаар судалгаа хийгдээгүй байна.
Энд бид CRISPRi системийг ашиглан том хэмжээний үйл ажиллагааны алдагдал дэлгэцийг хийж, DARS-AS1 lncRNA нь хэд хэдэн төрлийн хорт хавдрын эсийн өсөлтийг дэмждэг болохыг тогтоосон.Нэмж дурдахад бид үндсэн механизмыг тодорхойлсон: DARS-AS1 нь PACT-тай шууд холбогдож, PACT ба PKR-ийн холболтыг дарангуйлж, PKR-ийн доод субстрат болох eIF2α-ийн фосфоржилтоос сэргийлж, эцэст нь апоптозын эсийн үхлийг дарангуйлдаг.Эцэст нь хэлэхэд, бидний ажил DARS-AS1 lncRNA нь PACT-PKR замын зохицуулагч бөгөөд хорт хавдрын эмчилгээ, прогнозын боломжит зорилт болохыг харуулж байна.
Өргөн хүрээний геномын профайлын судалгаанууд нь хорт хавдартай холбоотой олон зуун lncRNA-г илрүүлсэн.Гэсэн хэдий ч тэдний үүрэг тодорхойгүй хэвээр байна56.Хорт хавдрын хөгжилд оролцдог ирээдүйтэй lncRNA нэр дэвшигчдийг тодорхойлохын тулд бид CRISPRi системийг ашиглан SW620 бүдүүн гэдэсний хорт хавдрын эсийн тархалтыг бууруулах үйл ажиллагааны алдагдал дэлгэцийг хийсэн (Зураг 1a).SW480 ба SW620 бүдүүн гэдэсний хорт хавдрын эсийн шугамын өвөрмөц онцлог нь нэг өвчтөнд анхдагч болон хоёрдогч хавдраас гаралтай байдаг.Энэ нь бүдүүн гэдэсний хорт хавдрын явц дахь генетикийн өөрчлөлтийг судлахад үнэ цэнэтэй харьцуулалтыг өгдөг.Тиймээс бид бүдүүн гэдэсний хорт хавдрын эсийн шугамын (SW480 ба SW620) транскриптомуудыг РНХ-ийн дараалал ашиглан шинжилж, хэвлэгдсэн уран зохиолоос зарим боломжит функциональ lncRNA-уудыг цуглуулсан.Эдгээр үр дүнд үндэслэн бид хорт хавдартай холбоотой 971 lncRNA-д чиглэсэн 7355 сгРНХ олиго, сөрөг хяналтын 500 онилгогүй сгРНХ олиго агуулсан sgRNA-ийн нэгдсэн санг зохион бүтээсэн (Нэмэлт мэдээлэл 1).
CRISPRi системийг ашиглан скрининг хийх бүдүүвч дүрслэл.b скрининг хийсний дараа sgRNA баяжуулах.Хэвтээ тасархай шугам нь log2 (нугалах өөрчлөлт) = ±0.58-ыг илэрхийлнэ.Босоо тасархай шугам нь p утга = 0.05 байна.Хар цэгүүд нь зорилтот бус sgRNA-г илэрхийлдэг (NC гэж тодорхойлсон).Улаан цэгүүд нь DARS-AS1-д чиглэсэн sgRNAs юм.Цэнхэр цэгүүд нь өмнө нь тайлбарласан онкоген lncRNA болох LINC00205-д чиглэсэн sgRNA юм.нугалах өөрчлөлт = (хэвийн заалт, 17 дахь өдөр)/(хэвийн заалт, 0 өдөр).c DARS-AS1 sgRNA-г устгаснаар эсийн өсөлтийг саатуулсан.Алдааны мөр нь гурван туршилтын ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 хоёр сүүлт Оюутны t-тест.d Хавдар дахь DARS-AS1 илэрхийлэл (TCGA мэдээллийн багц).em BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, COAD-тай өвчтөнүүдийн хосолсон хэвийн болон хавдрын дээж дэх DARS-AS1-ийн илэрхийлэл (TCGA мэдээллийн багц).p-утгыг хос хоёр сүүлт Студентийн t-тест ашиглан олж авсан.
Плазмид бүтээж, лентивирусыг савласны дараа бид дөрвөн бие даасан халдварын туршилтаар dCas9-SW620 бүдүүн гэдэсний хорт хавдрын эсийн шугамыг дээрх номын сантай шилжүүлсэн.Эдгээр халдварын халдварын олон талт (MOI) 0.1-0.3 байсан нь эс тус бүрийг зөвхөн нэг sgRNA-аар дамжуулж болохыг харуулж байна.18 хоногийн турш in vitro өсгөвөрлөсний дараа скрининг хийсний дараа зорилтот sgRNA-ийн баяжуулалтын профайл буурч эсвэл нэмэгдсэн бол зорилтот бус хяналтын олигонуклеотидын тоо өмнөх скринингтэй харьцуулахад харьцангуй өөрчлөгдөөгүй хэвээр байгаа нь бидний зорилтот скрининг өндөр өвөрмөц шинж чанартай болохыг харуулж байна. номын сан.Цагаан будаа.1b ба нэмэлт хүснэгт 1). Уушигны хорт хавдар болон элэгний хорт хавдрын явцыг дэмжинэ58,59,60 гэж өмнө нь мэдээлж байсан LINC00205-ыг илрүүлсэн (log2 (атираат өөрчлөлт) < −0.58, p утга < 0.05) нь энэхүү скрининг найдвартай байдлыг баталгаажуулсан (Зураг 1б). Уушигны хорт хавдар болон элэгний хорт хавдрын явцыг дэмжинэ58,59,60 гэж өмнө нь мэдээлж байсан LINC00205-ыг илрүүлсэн (log2 (атираат өөрчлөлт) < −0.58, p утга < 0.05) нь энэхүү скрининг найдвартай байдлыг баталгаажуулсан (Зураг 1б). LINC00205, о котором ранее сообщалось, chto on способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исклюинин (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), 1б). Уушигны хорт хавдар, элэгний хорт хавдрын явцыг дэмжинэ гэж өмнө нь мэдээлсэн LINC00205-ыг хассан (лог2 (нугалах өөрчлөлт) <-0.58, p-утга <0.05) нь энэхүү скрининг бат бөх болохыг баталж байна (Зураг .1б) . Linc00205 之前 被 被 可 促进 促进 肺癌 肺癌 和 进展 进展 <<<选 <<值 <<<<选 掉 <<<<<<(该 筛选 筛选 筛选 筛选 的 的 <的 的 的 的 的 的 (图 1b). Linc00205 之前 被 被 可 促进 促进 肺癌 肺癌 和 进展 进展 <<<选 <<值 <<<<选 掉 <<<<<<(该 筛选 筛选 筛选 筛选 的 的 <的 的 的 的 的 的 (图 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, chto on способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключени (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), энэ нь ямар нэг зүйл биш юм. 1б). Уушиг, элэгний хорт хавдрын явцыг 58,59,60 дэмжсэн гэж өмнө нь мэдээлсэн LINC00205-ыг хассан (log2 (нугалах өөрчлөлт) <-0.58, p-утга <0.05) нь энэхүү скрининг бат бөх болохыг баталж байна (Зураг .1b).
Туршилтанд хамрагдсан бүх lncRNA-уудын дотроос DARS-AS1-ийг мөн шалгасан бөгөөд 18 хоногийн өсгөвөрлөсний дараа гурван төрлийн sgRNA олигонуклеотид мэдэгдэхүйц багассан нь энэ lncRNA-г устгаснаар хорт хавдрын тархалт буурсан (Зураг 1b) байгааг харуулж байна.Энэ үр дүнг бүдүүн гэдэсний хорт хавдрын эсүүдэд хийсэн MTS шинжилгээгээр баталгаажуулж, DARS-AS1-ийг устгадаг эсийн өсөлтийн хурд нь хяналтын эсүүдтэй харьцуулахад ердөө хоёр дахин буурсан (Зураг 1c) ба бусад хэд хэдэн төрлийн хорт хавдрын өмнөх тайлантай нийцэж байгааг харуулсан.: тунгалаг эсийн бөөрний хорт хавдар, бамбай булчирхайн хорт хавдар, уушигны жижиг бус хорт хавдар51,52,53,55.Гэсэн хэдий ч бүдүүн гэдэсний хорт хавдрын үйл ажиллагаа, молекулын механизмыг судлаагүй хэвээр байна.Тиймээс бид цаашдын судалгаанд зориулж энэхүү lncRNA-г сонгосон.
Өвчтөнүүдийн DARS-AS1 илэрхийлэлийг судлахын тулд бид Хавдрын Геном Атлас (TCGA) төслийн 10,327 хавдрын дээжийг иж бүрэн шинжилсэн.Бидний үр дүнгээс харахад DARS-AS1 нь бүдүүн гэдэсний аденокарцинома (COAD), бөөрний тунгалаг эсийн хорт хавдар (KIRC), бөөрний папилляр эсийн хорт хавдар (KIRP) зэрэг янз бүрийн хавдрын эрүүл эсүүдэд өргөнөөр илэрхийлэгдэж, мэдэгдэхүйц нэмэгддэг болохыг харуулж байна..Маш цөөхөн (Зураг 1d ба Нэмэлт зураг 1a, b). Хосолсон эрүүл/хавдрын дээжийн шинжилгээ нь давсагны шээсний булчирхайн хорт хавдар (BLCA), бөөрний бөөрний тунгалаг эсийн хорт хавдар (KIRC), түрүү булчирхайн аденокарцинома (PRAD), уушигны хавтгай эсийн хорт хавдар (LUSC) зэрэг хавдруудад DARS-AS1-ийн илэрхийлэл мэдэгдэхүйц өндөр байгааг баталжээ. , умайн корпус эндометрийн хорт хавдар (UCEC), уушигны аденокарцинома (LUAD), элэгний элэгний хорт хавдар (LIHC), бөөрний бөөрний папилляр эсийн хорт хавдар (KIRP), бүдүүн гэдэсний аденокарцинома (COAD) (p утга < 0.05) (Зураг 1e–m) . Хосолсон эрүүл/хавдрын дээжийн шинжилгээ нь давсагны шээсний булчирхайн хорт хавдар (BLCA), бөөрний бөөрний тунгалаг эсийн хорт хавдар (KIRC), түрүү булчирхайн аденокарцинома (PRAD), уушигны хавтгай эсийн хорт хавдар (LUSC) зэрэг хавдруудад DARS-AS1-ийн илэрхийлэл мэдэгдэхүйц өндөр байгааг баталжээ. , умайн корпус эндометрийн хорт хавдар (UCEC), уушигны аденокарцинома (LUAD), элэгний элэгний хорт хавдар (LIHC), бөөрний бөөрний папилляр эсийн хорт хавдар (KIRP), бүдүүн гэдэсний аденокарцинома (COAD) (p утга < 0.05) (Зураг 1e–m) .Эрүүл/хавдрын хосолсон дээжийн шинжилгээ нь давсагны шээсний эсийн хорт хавдар (BLCA), тунгалаг эсийн бөөр ба бөөрний эсийн хорт хавдар (KIRC), түрүү булчирхайн аденокарцинома (PRAD), уушигны хавтгай эсийн хорт хавдар (LUSC) хавдарт DARS-AS1-ийн илэрхийлэл илт их байгааг баталсан., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) ба аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05e)– м) . , умайн биеийн эндометрийн хорт хавдар (UCEC), уушигны аденокарцинома (LUAD), элэгний элэгний хорт хавдар (LIHC), бөөрний папилляр эсийн хорт хавдар (KIRP), бүдүүн гэдэсний аденокарцинома (COAD) (p үнэ << 0.05) (Зураг 1e– m) .配对 健康 / 健康 的 进 一步 进 了 了 as as as as 尿路 上 (Prca), 前列 透明 上 上 (细胞癌 细胞癌), 前列 腺腺癌 细胞癌 上 (细胞癌 细胞癌) 皮癌 皮癌 (LUSC) 肿瘤 细胞癌 (LUSC) 肿瘤 皮癌 (LUSC) 肿瘤 (LUSC) 肿瘤显着 更 更 高 表达 表达 内膜 癌 癌 (ucec), 肺腺癌 (LUAD), 肝肝 细胞癌 细胞癌 细胞癌 (COAD) 和结肠腺癌 (COAD) 和结肠腺癌 (COAD) 和结肠腺癌 (COAD) 和结肠腺癌 (COAD) <0.05）（图1e-m） .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Эрүүл/хавдрын хосолсон дээжийн шинжилгээ нь давсагны шээсний эсийн хорт хавдар (BLCA), бөөрний тунгалаг эсийн хорт хавдар (KIRC), түрүү булчирхайн аденокарцинома (PRAD), уушгины хавтгай хучуур эдийн хорт хавдар (LUSC) зэрэгт DARS-AS1-ийн үүргийг цаашид дэмжсэн.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) ба аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,0)e. -м). умайн корпусын хорт хавдар (UCEC), уушигны аденокарцинома (LUAD), элэгний хорт хавдар (LIHC), бөөрний папилляр эсийн хорт хавдар (KIRP), бүдүүн гэдэсний аденокарцинома (COAD) (p утга <0.05) (Зураг 1e -m).Эдгээр үр дүнг нэгтгэн үзвэл DARS-AS1 нь янз бүрийн хорт хавдарт өргөн, өндөр илэрхийлэгддэг болохыг харуулж байна.
DARS-AS1 ба DARS (антисенс хэлхээг кодлодог ген) нь ижил дэмжигчийг хуваалцаж, бие биенийхээ хажууд байрладаг тул бид DARS-ыг бус харин DARS-AS1-ийг устгах зорилгоор shRNA-г зохион бүтээсэн (Нэмэлт Зураг 2a,b болон Нэмэлт Хүснэгт 2) .SW620-ээс гадна бид DARS-AS1-ийг их хэмжээгээр илэрхийлдэг өөр гурван эсийн шугамыг ашиглан shRNA-г задлах үйл ажиллагаа, үр нөлөөг судалсан (Нэмэлт Хүснэгт 3).Бидний үр дүнгээс үзэхэд боловсруулсан гурван shRNA нь дор хаяж 80% DARS-AS1-ийн уналтын үр ашигтай, DARS мРНХ-ийн хэмжээнд бага нөлөө үзүүлсэн (Нэмэлт зураг 2c-f).Нэмж дурдахад эдгээр shRNA-тай DARS-AS1-ийг устгасан нь бүдүүн гэдэсний хорт хавдрын SW620 (49.7%) ба HCT116 (27.7%), хөхний хорт хавдрын эсийн MBA-MD-231 (53.4%) дахь эсийн өсөлтийг мэдэгдэхүйц дарангуйлдаг болохыг бид олж мэдсэн.) болон HepG2 гепатомын эсийн шугам (92.7% бууралт), түүнчлэн тэдгээрийн бэхэлгээгүй бөмбөрцөг үүсгэх чадвар (эсийн шугам тутамд дунджаар ~50.8%, 44.6%, 40.7%, 75.7% бууралт) (Зураг 2a,b).SW620-д колони үүсэх шинжилгээний үр дүнгээс үзэхэд DARS-AS1 shRNA нь эсийн өсөлтийг мэдэгдэхүйц дарангуйлж, дунджаар ойролцоогоор 69.6%-иар буурсан (Зураг 2c).
SW620, HCT116, MBA-MD-231, HepG2 эсүүд дэх эсийн тархалт (a) ба бөмбөрцөг формацид (б) хяналтын shRNA болон DARS-AS1 shRNA-ийн нөлөө.c SW620 эсүүдэд колони үүсэхэд хяналтын shRNA ба DARS-AS1 shRNA-ийн нөлөө.DARS-AS1-ийг хэт ихээр илэрхийлэх SW620 эсийн эсийн өсөлт (d), бөмбөрцөг үүсэх (e), колони үүсэх (f).Үзүүлсэн өгөгдөл нь гурван туршилтын дундаж ± стандарт хазайлт юм.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, болон *** p ≤ 0.001 хоёр сүүлт Оюутны t-тестээр.
Үйл ажиллагааны алдагдалтай холбоотой судалгааг нөхөхийн тулд бид дараа нь DARS-AS1-ийг хэт их илэрхийлсэн SW620 эсүүдийг үүсгэсэн (Нэмэлт зураг 2g).DARS-AS1-ийн хэт их илэрхийлэл нь SW620 эсүүдэд эсийн өсөлтийг (1.8 дахин), зангуугүй бөмбөрцөг үүсэх (1.4 дахин), колони үүсэхийг (3.3 дахин) ихээхэн нэмэгдүүлсэн (Зураг 2d-f).Бид энэ үр дүнг өөр DARS-AS1 илэрхийлэгч A549 эсийн шугамыг ашиглан баталгаажуулсан.DARS-AS1 хэт ихэссэний улмаас эсийн өсөлтийг сайжруулсан нь A549 эсүүдэд ажиглагдсан (Нэмэлт Зураг 2h, i ба Нэмэлт Хүснэгт 3).Эдгээр олз, алдагдлын судалгаанууд нь DARS-AS1 нь in vitro хорт хавдрын эсийн өсөлтийг дэмждэг болохыг харуулж байна.
DARS-AS1 эсийн үржлийг зохицуулдаг үндсэн механизмыг судлахын тулд бид РНХ-ийн шинжилгээг хийж, түүний уураг холбох боломжит түншүүдийг тодорхойлсон.RT-qPCR үр дүнгээс үзэхэд DARS-AS1-ийн 86.2% нь SW620 эсийн цитоплазмд байршдаг (Нэмэлт зураг 3a).Дараа нь in vitro-д хуулбарласан биотинилсэн DARS-AS1 буюу псевдоРНХ-г SW620 эсийн лизатаар өсгөвөрлөж, дараа нь SDS-PAGE тусгаарласан.Дараачийн мөнгөн будалт нь DARS-AS1 татах дээжинд тодорхой зурвас (~38 кДа) их хэмжээгээр баяжуулсан боловч дамми РНХ эсвэл бөмбөлгүүдийг дээжид агуулаагүй болохыг харуулсан (Зураг 3a).Энэ зурвасыг масс спектрометрээр (MS) PKR идэвхжүүлэгч уураг (PACT) гэж тодорхойлж, SW620, HCT116, HepG2 эсийн шугамд иммуноблотын аргаар баталгаажуулсан (Зураг 3a,b).DARS болон холбогдох PACT уургууд болох PKR ба TRBP-ийн баяжуулалтыг мөн Western blotting (WB) аргаар РНХ-ийн шинжилгээг ашиглан судалсан.Үр дүн нь DARS-AS1 РНХ болон эдгээр гурван уургийн хооронд шууд харилцан үйлчлэл илрээгүй болохыг харуулж байна (Нэмэлт Зураг 3b).DARS-AS1 ба PACT-ийн хоорондын өвөрмөц харилцан үйлчлэлийг РНХ-ийн дархлал тунах (RIP) шинжилгээгээр баталгаажуулсан бөгөөд энэ нь DARS-AS1 нь PACT-ын эсрэг эсрэгбиемүүдээр ихээхэн баяжуулсан боловч бусад хяналтын РНХ-д биш гэдгийг харуулсан (Зураг 3c).DARS-AS1 нь бусад эсийн бүрэлдэхүүн хэсгүүд байхгүй үед PACT-тай шууд харьцдаг эсэхийг тодорхойлохын тулд цэвэршүүлсэн PACT ашиглан in vitro био давхаргын интерферометрийн (BLI) шинжилгээг хийсэн.Биотин шошготой DARS-AS1 буюу дамми РНХ-ийг стрептавидин (SA) биосенсорууд дээр хөдөлгөөнгүй болгож, дараа нь 1 мкм PACT агуулсан кинетик буферт өсгөвөрлөсөн.PACT нь DARS-AS1 (KD утга ~26.9 nM) -тэй хүчтэй холбогддог боловч РНХ-ийг дуурайдаггүй (Зураг 3d).Эдгээр үр дүнг нэгтгэж үзвэл DARS-AS1 болон PACT хоёрын хооронд шууд харилцан үйлчлэл, өндөр хамааралтай болохыг харуулж байна.
РНХ татах шинжилгээгээр DARS-AS1 SW620 эсийн PACT-тай харилцан үйлчлэлцэж байгааг илрүүлсэн.Дээр нь холбогдох уургийн мөнгөн будалт.Доод дархлаажуулалтыг PACT эсрэгбиемээр хийсэн.b РНХ-ийн задлах шинжилгээг HCT116 (дээд) болон HepG2 (доод) эсүүдэд хийсэн.PACT баяжуулалтыг иммуноблотын аргаар илрүүлсэн.CRNA-ийн дархлал тунадасжих (RIP) шинжилгээг заасан эсрэгбиемүүдийг ашиглан SW620 эсүүдэд хийсэн.d Бүрэн хэмжээний DARS-AS1 буюу хяналтын РНХ-тай PACT холбох муруйг био давхаргын интерферометр (BLI) ашиглан олж авсан.РНХ-ийг стрептавидины биосенсор дээр хөдөлгөөнгүй болгосон.Холболтыг хэмжихийн тулд 1 μM PACT ашигласан.e РНХ татах шинжилгээг биотинжүүлсэн бүрэн хэмжээний DARS-AS1 буюу тайрсан (дээд талд) ашиглан хийсэн.Хүлээн авсан PACT-ыг харуулсан иммуноблот (доод).f Цэвэршүүлсэн дарцагласан PACT-ийг биотинжүүлсэн бүрэн хэмжээний DARS-AS1-ээр өсгөвөрлөсөн эсвэл in vitro RIP шинжилгээнд зориулж тайрсан (e-ийн адил).Олж авсан РНХ-г RT-qPCR-ээр баталгаажуулсан.g Өөр өөр РНХ-ийн фрагментуудын PACT-тай харьцангуй ойр байдлыг био давхаргын интерферометр ашиглан олж авсан.Шинжилгээнд 100 нМ РНХ ба 1 μМ RAST ашигласан.h In vitro RIP шинжилгээг цэвэршүүлсэн бүрэн бүтэн эсвэл таслагдсан PACT шошго ашиглан хийсэн.Олж авсан РНХ-г RT-qPCR-ээр баталгаажуулсан.i DARS-AS1, PACT эсвэл хоёуланг нь хэт их илэрхийлдэг SW620 эсийн өсөлтийн хурд.j SW620 эсэд бүрэн хэмжээний буюу таслагдсан DARS-AS1-ийн хэт их илэрхийлэл нь эсийн өсөлтөд өөр өөр нөлөө үзүүлсэн.k Апоптозыг PARP-ын эсрэг эсрэгбиетэй иммуноблотын аргаар илрүүлсэн.l DARS-AS1-ийн уналт нь урсгалын цитометрээр харуулсан шиг SW620 эсийн апоптозыг өдөөдөг.Үзүүлсэн өгөгдөл нь гурван туршилтын дундаж ± стандарт хазайлт юм. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, хоёр сүүлт Оюутны t тестээр. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, хоёр сүүлт Оюутны t тестээр. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 хоёр сүүлт Оюутны t-тестээр. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 хоёр сүүлт Оюутны t-тестээр.
Дараа нь бид PACT холбоонд шаардлагатай DARS-AS1 бүсийг тодорхойлохын тулд in vitro транскрипцээр биотинжүүлсэн DARS-AS1 РНХ-ийн гурван фрагментийг үүсгэсэн (Зураг 3e).РНХ-ийн шинжилгээний үр дүнгээс үзэхэд фрагмент бүр PACT-тай харьцах боломжтой боловч 3′-терминал бүс (A3 шошготой 384-768 нуклеотид) нь A1 гэсэн шошготой 1-384 нуклеотидээс илүү байгааг харуулсан (Зураг 3e).Үүнтэй төстэй үр дүн нь рекомбинант PACT ашиглан in vitro RIP шинжилгээнд ажиглагдсан (Зураг 3f).Эдгээр үр дүнтэй нийцэж, BLI ашиглан хөдөлгөөнгүй РНХ-ийн хэсгүүдийг PACT-тай холбох туршилтууд нь PACT нь A3 (384-768 nt) (KD утга нь ойролцоогоор 94.6 нМ) -тай илүү их хамааралтай, бусад хэсгүүдтэй бараг холбоогүй болохыг харуулсан.(Зураг 3d).
Бид мөн PACT-д холбогдох холбох бүсүүдийг шалгасан.PACT нь гурван функциональ домэйн агуулдаг бөгөөд тэдгээрийн хоёр нь хадгалагдсан давхар хэлхээтэй РНХ холбогч домэйн (dsRBD) ба гурав дахь домэйн (D3-г тодорхойлсон) бөгөөд уургийн харилцан үйлчлэлийн идэвхжүүлэгчийн үүрэг гүйцэтгэдэг.Домэйн бүрийн lncRNA-г холбох чадварыг шалгахын тулд бид гурван домэйн тус бүрийг устгасан гурван мутацийг зохион бүтээж, in vitro RIP шинжилгээ хийсэн.Бидний үр дүнгээс харахад PACT-ийн гуравдахь домэйн (D3) устгасан нь DARS-AS1-тэй харилцан үйлчлэлээ мэдэгдэхүйц бууруулж (бүрэн бүтэн PACT-тай харьцуулахад 0.11 дахин) бусад хоёр мутацитай харьцуулахад (Зураг 3h), энэ нь суллагдсан болохыг харуулсан. D3-ийн DARS-тай харилцан үйлчлэлцсэн.-AC1.Эдгээр үр дүнг нэгтгэснээр DARS-AS1 ба PACT хоорондын харилцан үйлчлэл нь DARS-AS1-ийн 3′ төгсгөл ба PACT-ийн D3 домэйнээр дамждаг болохыг харуулж байна.
DARS-AS1 нь PACT илэрхийлэлд, PACT нь DARS-AS1-д ямар ч нөлөө үзүүлээгүй (Нэмэлт Зураг 3c) гэдгийг бид тэмдэглэсэн.Дараа нь бид PACT-ийн цохилтын эсийн өсөлтөд үзүүлэх нөлөөг судалсан.DARS-AS1-ээс ялгаатай нь PACT-ыг унасан үед харьцангуй эсүүд 1.5-3 дахин хурдан өссөн (Нэмэлт зураг 3d).Колони үүсэх шинжилгээний үр дүн нь PACT-тай shRNA эмчилгээ хийсний дараа эсүүд 2-3 дахин колони үүсгэсэн болохыг харуулж байна (Нэмэлт зураг 3e).DARS-AS1 нь PACT-ээр дамжуулан эсийн үржлийг зохицуулдаг эсэхийг шалгахын тулд бид PACT, DARS-AS1 эсвэл хоёуланг нь хэт их илэрхийлсэн SW620 эсийг үүсгэсэн.PACT-ийн хэт их илэрхийлэл нь эсийн өсөлтийг мэдэгдэхүйц дарангуйлдаг болохыг харуулсан (Зураг 3i).DARS-AS1-ийн хэт их илэрхийлэл нь эсийн өсөлтийг ихээхэн дэмждэг боловч DARS-AS1 болон PACT-ыг хэт их хэмжээгээр илэрхийлдэг эсийн өсөлтийн хурдад мэдэгдэхүйц ялгаа байгаагүй.Эдгээр үр дүн нь PACT нь DARS-AS1-ийн хэт илэрхийлэлээс үүдэлтэй өсөлтийн өсөлтийг эсэргүүцэж чадна гэдгийг харуулж байна.
DARS-AS1-ийн өөр өөр бүсүүд нь өөр өөр PACT-ийг холбох чадвартай байдаг тул бид DARS-AS1 фрагментийн өөр өөр хэт илэрхийлэлээр эсийн үржилд харьцангуй нөлөөллийг судалсан.Бусад хоёр фрагменттай харьцуулахад DARS-AS1 нь эсийн үржлийг өдөөх хамгийн өндөр чадвартай DARS-AS1-ийн PACT-тай холбоотой гол бүс болох 3′ төгсгөлд (384-768 nt) хэт их илэрхийлэгддэг (Зураг 3j).Эдгээр үр дүн нь DARS-AS1-ийн холбох чадвар болон биологийн үйл ажиллагааны хооронд эерэг хамаарлыг харуулж байна.
PACT нь апоптозын эсрэг уураг гэж мэдээлсэн19.Тиймээс бид DARS-AS1-ийн апоптозд үзүүлэх нөлөөг судалсан.Хүлээгдэж буйчлан DARS-AS1-ийн уналт нь SW620 эсүүд дэх PARP задралыг мэдэгдэхүйц нэмэгдүүлж, SW620, HCT116, HepG2, MBA-MD-231 эсийн шугам дахь анексины V-эерэг эсийн эзлэх хувийг нэмэгдүүлсэн (Зураг 3k).3).3f-h) нь хорт хавдрын эсүүдэд DARS-AS1-ийн апоптозын эсрэг нөлөө нь PACT-ийн апоптозыг өдөөдөг функцээс эсрэг байгааг харуулж байна.Эдгээр үр дүнг нэгтгэснээр DARS-AS1-ийн онкоген үйл ажиллагааны механизм нь PACT функцийг дарангуйлах замаар байж болохыг харуулж байна.
Дараа нь бид DARS-AS1-PACT холбооны үйл ажиллагааны үр дагаврыг судалсан.PACT нь шууд харилцан үйлчлэлээр PKR-ийг идэвхжүүлдэг гэж мэдээлсэн бөгөөд энэ нь eIF2α фосфоржилтыг сайжруулж, орчуулгын устгал болон апоптоз17 үүсгэдэг.Эхлээд бид DARS-AS1 нь PACT ба PKR-ийн эсийн нутагшуулалтад нөлөөлж байгаа эсэхийг шалгасан.Конфокаль флюресценцийн микроскопоор PACT ба PKR нь SW620 эсүүдэд өндөр зэрэгцэн оршдог болохыг Пирсон корреляцийн дундаж коэффициент 0.72 харуулсан.Үүний зэрэгцээ, DARS-AS1-ийн хэт илэрхийлэл нь PACT болон PKR-ийн хамтын байршлыг мэдэгдэхүйц бууруулсан (Пирсон корреляцийн коэффициент 0.61) (Зураг 4a).DARS-AS1 нь PACT-PKR-ийн харилцан үйлчлэлийг зохицуулж чадах эсэхийг судлахын тулд бид SW620 эсийн лизат дахь PACT эсрэгбиеийн эсрэг дархлаажуулалт (co-IP) шинжилгээг хийсэн.PKR нь хяналтын эсүүд дэх PACT-ийн эсрэг бодисоор их хэмжээгээр баяжуулсан бол DARS-AS1-ийг хэт их хэмжээгээр илэрхийлсэн эсүүдээс PKR-ийн нөхөн сэргэлт мэдэгдэхүйц буурсан байна (Зураг 4b).Цэвэршүүлсэн шошготой PACT ба PKR-ийг in vitro уураг холбох шинжилгээнд ашигласан.Үүний дагуу DARS-AS1-ийг хангасан боловч хяналтын РНХ байхгүй хүмүүс PACT-PKR-ийн харилцан үйлчлэлийг дарангуйлсан (Зураг 4c).Бүх үр дүн нь DARS-AS1 нь PACT болон PKR холболтыг тасалдуулсан болохыг харуулсан.
a Хяналтын эсүүд эсвэл DARS-AS1-ийг хэт их хэмжээгээр илэрхийлдэг эсүүдэд PACT ба PKR-ийн хамт нутагшсан байдал нь төвлөрсөн флюресцент микроскоп ашиглан ажиглагдсан.Цөмүүдийг DAPI-ээр будсан.Статистикийн үр дүнг 16 гэрэл зургаас авсан.b Хяналтын SW620 эсүүд эсвэл DARS-AS1-ийг хэт их хэмжээгээр илэрхийлдэг эсийн лизат дахь PACT эсрэгбиеийг ашиглан хамтарсан иммунопреципитаци (co-IP).c шошготой PACT, цэвэршүүлсэн PKR ба DARS-AS1 эсвэл хуурамч РНХ-тай in vitro-д хуулбарласан уураг холбох шинжилгээнд зориулж өсгөвөрлөсөн.Дархлаажуулалтын эсрэг тугны эсрэгбиемүүдийг ашигласан.d Заасан эсрэгбие бүхий иммуноблотыг хяналтын shRNA эсвэл DARS-AS1-shRNA-тай нян шилжүүлсэн SW620 болон HCT116 эсүүдэд хийж, дараа нь ийлдэс өлсгөлөнд автсан.e DARS-AS1-ийн илэрхийлэлийн түвшин нь thapsigargin-д эсийн мэдрэмжийг өөрчилсөн.SW620 эсийг DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 хэт экспрессийн плазмид эсвэл хяналтын плазмидаар дамжуулсан.Эсийг 48 цагийн турш thapsigargin-ээр эмчилж, эсийн амьдрах чадварыг MTS урвалжаар тогтоов.f In vitro-д хуулбарласан DARS-AS1 эсвэл дамми РНХ болон цэвэршүүлсэн PACT-ийг in vitro идэвхжүүлэлтийн шинжилгээ болон иммуноблот илрүүлэхэд ашигласан.g Эдгээр эсрэгбиемүүдийг ашиглан иммуноблотыг SW620-ctrl эсүүд (зүүн талд) эсвэл PKR мутантыг хэт их илэрхийлдэг эсүүд (баруун) дээр хийсэн.Дараа нь эдгээр эсүүдийг хяналтын shRNA эсвэл DARS-AS1-shRNA-ээр дамжуулж, дараа нь ийлдэс өлсгөлөнд автсан.h Урсгалын цитометр нь мутант PKR-ийн идэвхгүйжүүлэлт нь SW620 эсэд DARS-AS1-ээр өдөөгдсөн апоптозыг нөхөж байгааг харуулсан.i Заасан эсрэгбие бүхий иммуноблотыг SW620 (зүүн) эсвэл HCT116 (баруун) эсүүдэд хийсэн.Хяналтын shRNA эсвэл DARS-AS1 shRNA-тай нянжуулсан эсүүд ийлдэс дутагдаж, 100 нМ PKR C16 дарангуйлагч буюу DMSO-ээр нэмэгддэг.Хуваарийн мөр = 5 мкм.Үзүүлсэн өгөгдөл нь гурван туршилтын дундаж ± стандарт хазайлт юм.* p ≤ 0.05 хоёр сүүлт Оюутны t-тест.
PACT нь PKR17-тэй харилцан үйлчилбэл Thr451 дэх PKR фосфоржилтыг өдөөж болно гэж ерөнхийд нь үздэг.Бидний үр дүн нь ийлдэс өлсгөлөнгийн дараа DARS-AS1-ийн уналтанд орсон эсүүдэд PKR фосфоржилтын түвшин мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн болохыг харуулж байна (Зураг 4d ба Нэмэлт зураг 4a).Үүний дагуу бид PKR-ийн үндсэн субстрат болох eIF2α-ийн фосфоржилтыг DARS-AS1 shRNA-аар их хэмжээгээр нэмэгдүүлсэн болохыг олж мэдсэн (Зураг 4d ба Нэмэлт зураг 4а).Тапсигаргин нь ER-ийн стресс үүсгэгч бөгөөд ER-ээс Ca2+ ялгаруулдаг.Тапсигаргинтай эмчилгээ нь PACT-ийн илэрхийлэл, идэвхжлийг өдөөдөг бөгөөд энэ нь PKR-тэй харилцан үйлчилж, идэвхжүүлж, eIF2α фосфоржилтыг нэмэгдүүлснээр апоптозд хүргэдэг 18,61.Энд бид DARS-AS1 нь PACT/PKR замыг дарангуйлснаар эсийг стрессийг даван туулахад тусалж чадах эсэхийг судлахын тулд thapsigargin-ийг PACT/PKR замын өдөөгч болгон ашигласан.DARS-AS1-ийн илэрхийлэлийн түвшин нь thapsigargin-ийн эсийн эсэргүүцэлтэй эерэг хамааралтай болохыг бид ажигласан.DARS-AS1-ийг хэт их хэмжээгээр илэрхийлдэг SW620 эсүүд нь thapsigargin-ээр эмчлэхэд илүү сайн амьд үлдсэн бол DARS-AS1-ийг устгасан эсүүд илүү мэдрэмтгий болсон (Зураг 4e).Эдгээр үр дүнтэй нийцүүлэн DARS-AS1-ийн хэт их илэрхийлэл нь тапсигаргинаар өдөөгдсөн PKR фосфоржилтыг бууруулсан (Нэмэлт зураг 4б).Үүний эсрэгээр, thapsigargin эмчилгээ хийсний дараа PKR болон eIF2α нь хяналтын эсүүдтэй харьцуулахад DARS-AS1-ийн задралын эсүүдэд илүү их хэмжээгээр фосфоржсон (Нэмэлт зураг 4b).Сонирхолтой нь, thapsigargin нь DARS-AS1-ийн илэрхийлэлийг тунгаас хамааралтай байдлаар өдөөдөг бөгөөд энэ нь DARS-AS1-ийн стрессийн эсрэг функцийг илэрхийлж болно (Нэмэлт зураг 4c).Нэмж дурдахад бид эдгээр ажиглалтыг баталгаажуулахын тулд in vitro идэвхжүүлэлтийн шинжилгээ хийсэн.Товчхондоо, PKR-ийг эсийн лизатаас PKR-ийн эсрэг эсрэгбие ашиглан цэвэршүүлж, дараа нь рекомбинант PACT болон in vitro-д хуулбарласан DARS-AS1-ээр өсгөвөрлөсөн.Ферментийн урвалын дараа WB ашиглан фосфо-ПКР-ийг илрүүлсэн.Бидний үр дүнгээс харахад PKR-ийн фосфоржилтыг DARS-AS1 их хэмжээгээр дарангуйлсан боловч хяналтын РНХ-ээр биш (Зураг 4f).Эдгээр in vitro болон in vivo үр дүн нь DARS-AS1 нь PACT-зуучлагдсан PKR идэвхжүүлэлтийг дарангуйлдаг болохыг харуулж байна.Үүний зэрэгцээ бид DARS-AS1 (Зураг 4f) байгаа үед PACT-ийн сэргэлт буурч байгааг ажигласан.Энэ үр дүн нь in vitro уураг холбох шинжилгээний үр дүнтэй (Зураг 4c) нийцэж байгаа бөгөөд PACT-PKR холбоонд зориулсан DARS-AS1-ийн хаах функцийг дахин харуулж байна.
PACT-ийн D3 домэйн дэх Ser246 ба Ser287 нь эсийн стрессийн дор PKR-ийг идэвхжүүлэхэд шаардлагатай.Хоёр сериний үлдэгдлийг аланинаар орлуулснаар PACT (mutD) мутант үүссэн бөгөөд энэ нь стресс байхгүй үед PKR-ийг идэвхжүүлж, аланиныг (mutA) орлуулах нь протоколыг өөрчилсөн.Бид DARS-AS1-тэй шууд холбоотой энэ домэйны ач холбогдлыг харуулсан тул эдгээр үлдэгдэл нь DARS-AS1-тэй харилцан үйлчлэлцэх боломжтой эсэхийг шалгахын тулд эдгээр хоёр PACT мутантыг үүсгэсэн.Сонирхолтой нь хоёр мутант хоёулаа DARS-AS1-тэй холбогдох чадвараа алдсан (Нэмэлт зураг 4d) нь DARS-AS1-тэй үр дүнтэй харилцан үйлчлэхийн тулд PACT уургийн бүрэн бүтэц шаардлагатай байж магадгүй юм.
Цаашилбал, бидний үр дүнгээс үзэхэд DARS-AS1-shRNA-аас үүдэлтэй эсийн өсөлтийг дарангуйлах нь давамгайлсан сөрөг PACT мутант (PACTmutA) эсвэл давамгайлсан сөрөг PKR мутант (PKRmut) (Нэмэлт зураг 4e. e) -ийг хэт их илэрхийлснээр хэсэгчлэн сэргээж болно.Давамгай-сөрөг PKR мутантуудын хэт их илэрхийлэл нь DARS-AS1-ийн уналтаас үүдэлтэй PKR фосфоржилт, түүнчлэн ийлдэс дутагдсан эсэд eIF2α фосфоржилтыг бууруулсан (Зураг 4g).Хамгийн чухал нь PKRmut-ийг хэт их илэрхийлсэн эсүүдэд DARS-AS1-ийн уналтаас үүдэлтэй апоптозын эсийн эзлэх хувь буурсан байна (Зураг 4h ба Нэмэлт зураг 4g).PKR киназын идэвхжилийг дарангуйлах нь DARS-AS1-ийн үйл ажиллагааг алдагдуулдаг тул үр дүн нь эсийг PKR-тусгай C16 дарангуйлагчаар эмчлэхэд DARS-AS1-ийн уналт нь PKR болон eIF2α фосфоржилтыг ховор өдөөдөг болохыг харуулсан (Зураг 4i ба Нэмэлт зураг 4h).).Хамтдаа авч үзвэл, DARS-AS1 нь PACT-зуучлагдсан PKR идэвхжилтийг дарангуйлснаар эсийн өсөлтийг дор хаяж хэсэгчлэн дэмждэг болохыг харуулж байна.
Хавдар үүсэхэд DARS-AS1-ийн үүргийг цаашид судлахын тулд бид хулганын ксенографт загвар ашиглан in vivo туршилт хийсэн. Үр дүн нь DARS-AS1-ийн уналт нь хулганад хавдрын өсөлтийг эрс бууруулдаг болохыг харуулж байна (p утга <0.0001) (Зураг 5a). Үр дүн нь DARS-AS1-ийн уналт нь хулганад хавдрын өсөлтийг эрс бууруулдаг болохыг харуулж байна (p утга <0.0001) (Зураг 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Үр дүн нь DARS-AS1-ийг буулгах нь хулгана дахь хавдрын өсөлтийг эрс бууруулдаг болохыг харуулж байна (p утга <0.0001) (Зураг 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Үр дүн нь DARS-AS1-ийн уналт нь хулгана дахь хавдрын өсөлтийг мэдэгдэхүйц бууруулсан болохыг харуулсан (p утга <0.0001) (Зураг 5a).Тиймээс DARS-AS1-ийг буулгах бүлэгт хавдрын дундаж хэмжээ ойролцоогоор 72.9%, хавдрын дундаж масс 87.8% орчим буурсан байна (Зураг 5b-d).Эдгээр үр дүн нь DARS-AS1 нь in vivo хавдрын өсөлтийг ихээхэн дэмжиж чадна гэдгийг баттай харуулж байна.
Нүцгэн хулганад бүдүүн гэдэсний хорт хавдар үүсэхэд DARS-AS1-ийн зар сурталчилгааны нөлөө.Өсөлтийн муруй (a), хавдрын хэмжээ (b), жин (в), хавдрын зургийг (d) үзүүлэв.Алдааны мөр нь ±SEM-ийг илэрхийлнэ. n = 10. ****p < 0.0001, хоёр сүүлт Оюутны t тестээр. n = 10. ****p < 0.0001, хоёр сүүлт Оюутны t тестээр. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 хоёр сүүлт Оюутны t тест.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 хоёр сүүлт Оюутны t тест.e Каплан-Мейер нь UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, LGG бүхий өвчтөнүүдийн DARS-AS1-ийн илэрхийлэлийн түвшин болон нийт эсэн мэнд үлдэх хоорондын хамааралд дүн шинжилгээ хийсэн.Өвчтөнд DARS-AS1 илэрхийллийн өндөр түвшин нь эхний 50% -д байсан;өвчтөнүүдэд DARS-AS1 илэрхийллийн доод түвшин доод 50% -д байсан.p-утгыг бүртгэлийн зэрэглэлийн тест ашиглан тодорхойлсон.f DARS-AS1 нь PACT-PKR зам болон хавдрын өсөлтийг зохицуулдаг загвар.
DARS-AS1-ийн эмнэлзүйн нөлөөг илүү сайн ойлгохын тулд бид түүний илэрхийлэл болон өвчтөний эсэн мэнд үлдэх хоорондын хамаарлыг судалсан.TCGA мэдээллийн багцад дүн шинжилгээ хийснээр бид DARS-AS1-ийн өндөр илэрхийлэл нь увеаль меланома (UVM), бөөрний хромофоби (KICH), бөөрний папилляр эсийн хорт хавдар (KIRP), мезотелиома (MESO), мультиплекстэй холбоотой болохыг олж мэдсэн.Глиобластомын морфоз (GBM) болон тархины бага зэргийн глиома (LGG) бүхий өвчтөнүүдэд эсэн мэнд амьдрах чадвар бага байсан (Зураг 5e).Эдгээр үр дүн нь DARS-AS1 нь хавдрын эмнэлзүйн хөгжилд чухал үүрэг гүйцэтгэж, олон төрлийн хорт хавдрын урьдчилан таамаглах биомаркер байж болохыг харуулж байна.
Энэхүү судалгаагаар CRISPRi-ийн том хэмжээний функциональ скрининг ашиглан бид DARS-AS1 lncRNA нь PACT болон PKR гэсэн хоёр гол стресс хариулагчийг зохицуулах замаар хорт хавдрын эсийн стрессийг даван туулдаг болохыг тогтоосон.DARS-AS1 нь PACT-тай шууд харилцан үйлчлэлцсэнээр PACT-зуучлагдсан PKR идэвхжүүлэлтийг дарангуйлж, улмаар апоптозын эсийн үхлээс сэргийлж, эсийн үржлийг дэмждэг (Зураг 5f).DARS-AS1-ийн зохицуулалт нь олон төрлийн хорт хавдрын үед ажиглагдсан нь стресстэй нөхцөлд хорт хавдрын эсийн оршин тогтнохыг дэмжих функц нь олон төрлийн хорт хавдарт өргөн хэрэглэгддэг болохыг харуулж байна.
PACT нь PKR идэвхжүүлэгч уураг болох нь тогтоогдсон бөгөөд PACT-ээр дамжсан PKR идэвхжүүлэлт нь транскрипц, орчуулга, апоптоз болон бусад чухал эсийн үйл явцыг зохицуулах замаар стрессийн хариу урвалд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг62.Хэдэн арван жилийн турш PACT-PKR каскадын хорт хавдрын өвөрмөц зохицуулалтыг ойлгохыг оролдсон.Энд бидний судалгаагаар PACT-тай шууд холбогдож, PACT-PKR-ийн харилцан үйлчлэлийг хааж, PKR идэвхжүүлэлт болон eIF2α фосфоржилтыг дарангуйлж, улмаар стрессээс үүдэлтэй апоптозыг дарангуйлдаг эсийн lncRNA DARS-AS1-ээр дамжуулан хорт хавдрын эсүүдэд PACT-PKR-ийн зохицуулалтын өөр механизм илэрсэн. хорт хавдрын эцсийн тархалтыг өдөөдөг.эсүүд.Энэхүү нээлт нь хорт хавдрын прогноз, эмчилгээний боломжит lncRNA зорилтуудыг тодруулсан.
Бидний мэдээлэл нь DARS-AS1-ийн уналт нь эсийг сийвэнгийн өлсгөлөнг мэдрэмтгий болгож, фосфоржуулсан PKR болон eIF2α-ийг ихээхэн нэмэгдүүлдэг болохыг харуулсан.Эдгээр үр дүн нь DARS-AS1 нь PACT/PKR үйл ажиллагааг дарангуйлснаар хатуу ширүүн нөхцөлд хорт хавдрын эсийн амьд үлдэхийг дэмждэг болохыг харуулж байна.ASPACT ба nc886 зэрэг бусад хэд хэдэн кодчилдоггүй РНХ нь PACT48 мРНХ-ийн зохицуулалтыг бууруулж эсвэл PKR49,50,64-тэй холбогдож автофосфоржилтыг зохицуулах замаар PACT/PKR тэнхлэгт оролцдог.Тэдгээрийн дотроос DARS-AS1 нь PACT-PKR холбоог тасалдаг.Энэхүү судалгаа нь PACT/PKR тэнхлэгийн зохицуулалт болон стрессийн хариу урвал дахь lncRNA-ийн үүргийн талаарх бидний ойлголтыг баяжуулж өгдөг.
PACT нь гурван тусдаа домэйн агуулдаг.Эхний хоёр dsRBD тус бүр нь PACT-ийг PKR-тэй өндөр нягтаршилтай холбоход хангалттай байдаг бол гурав дахь домайн (D3) нь PKR-ийг in vitro болон in vivo идэвхжүүлэхэд шаардлагатай байдаг.Бидний судалгаагаар DARS-AS1 нь D3 домэйнтэй илүү сайн харьцдаг болохыг харуулсан (Зураг 3h).LncRNA (768 нуклеотид) том хэмжээтэй тул DARS-AS1 нь D3-тай холбогддог нь dsRBD ба PKR-ийн PACT домэйны хоорондын харилцан үйлчлэлийг физикийн хувьд дарангуйлж, улмаар PACT ба PKR-ийн холбоог хаадаг.D3 дахь Ser246 ба Ser287-ийг аланин эсвэл аспартатаар сольсон PACT цэгийн мутаци нь түүний DARS-AS1-тэй холбогдох хамаарлыг тасалдуулж, тэдгээрийн холбоонд D3-ийн ерөнхий бүтцийн болон цахилгаан шинж чанарууд чухал болохыг харуулж байна.Энэ механизмын талаар илүү нарийвчилсан биохимийн шинжилгээ, өндөр нарийвчлалтай PACT бүтцийн шинжилгээг ашиглан ирээдүйд шаардлагатай болно.
Өмнөх судалгаагаар DARS-AS1 нь хэд хэдэн механизмаар эсийн үржлийг дэмждэг гэж мэдээлсэн байдаг51,52,53.Нэгэн жишээнд судлаачид DARS-AS1 нь бөөрний хорт хавдрын эсүүдэд miP-194-5p-ийг онилох замаар антисенс уураг кодлодог DARS генийг сайжруулж байгааг ажигласан.Гэсэн хэдий ч энэхүү судалгаагаар DARS-AS1-ийн уналт нь олон төрлийн хорт хавдар, тэр дундаа бүдүүн гэдэсний хорт хавдар, хөхний болон элэгний хорт хавдар зэрэгт DARS транскрипцид бага нөлөө үзүүлсэн.lncRNA-ууд нь эс болон эд эсийн өвөрмөц илэрхийллийн хэв маягийг харуулдаг тул хорт хавдрын төрлүүдэд функциональ механизмууд хадгалагдаагүй байж болох бөгөөд энэ нь бидний ажиглалт болон янз бүрийн хорт хавдрын өмнөх үнэлгээний хоорондын зөрүүг үүсгэж болзошгүй юм.Төрөл бүрийн физиологийн болон эмгэг процессуудын тодорхой механизмыг тодруулахын тулд тусгай судалгаа хийх шаардлагатай.
Эмнэлзүйн мэдээлэлд хийсэн дүн шинжилгээ нь хавдар дахь DARS-AS1-ийн илрэл нь хорт хавдартай өвчтөнүүдийн эсэн мэнд үлдэхтэй урвуу хамааралтай болохыг харуулсан бөгөөд энэ нь хорт хавдрын таамаглалд DARS-AS1/PACT/PKR тэнхлэгийн ач холбогдлыг онцолж байна.Дүгнэж хэлэхэд, бидний судалгаагаар DARS-AS1 нь PACT/PKR дохионы тэнхлэгийг зохицуулагч, хорт хавдрын эсийн үржлийг дэмжиж, стрессийн хариу урвалын үед апоптозыг дарангуйлдаг нь өөр нэг судалгааны чиглэл болж, боломжит эмчилгээний талаар цаашдын судалгаанд сонирхолтой болохыг харуулж байна. .
Хүний эсийн SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 болон HEK293T-ийг Хятад дахь Үндэсний эсийн шугамын нөөцийн дэд бүтцээс авсан.Бүх эсийг DMEM орчинд (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) болон 1% пенициллин-стрептомицин (Thermo Fisher Scientific) нэмэлтээр 37°C, 5% CO2-т хадгалсан.инкубатор.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Тугны эсрэг, Абкам (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));эсрэг eIF2α (фосфор S51), Abcam (ab32157);эсрэг PACT (фосфор S246), Abgent (AP7744b);анти-β-тубулин, CST (2128);хэвийн хулгана IgG, CST (5415S);хэвийн туулай IgG, CST (2729S).Эсрэгбиеийг Western blotting-д PBST-д 1:1000, IP-д 1:100 харьцаагаар шингэлэв.
sgRNAs нь CRISPR-ERA66 хэмээх олон нийтэд нээлттэй хэрэгслийг ашиглан боловсруулсан.Бид sgRNA-г боловсруулахдаа анхдагч хэрэгслийн параметрүүдийг ашигласан ба 3 kb бүсэд sgRNA холбох сайтуудыг алгоритмаар тооцсон.TSS дээр төвлөрсөн.sgRNA олигонуклеотидын санг CustomArray, Inc.-д (Bothewell, WA) нийлэгжүүлж, pgRNA плазмидуудыг хүнжүүлсэн (Addgene #44248) болгон хуваасан.Нийт 12 мкг хүнжүүлсэн pgRNA плазмид, 7.2 мкг psPAX2 (Addgene # 12260), 4.8 мкг pMD2.G (Addgene # 12259) 10 мкг хүнжүүлсэн pgRNA плазмидыг 10 х 106 HEK293T-т DNA-ийн дисфекцийг ашиглан 5 x 106 HEK293T-т шилжүүлэн суулгасан. эсүүд (CWBIO, Бээжин, Хятад) үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу.Вирус агуулсан супернатантыг шилжүүлснээс хойш 48 ба 72 цагийн дараа цуглуулж, 0.45 микрон шүүлтүүрээр шүүсэн.Скрининг хийхдээ dCas9/KRAB хайлуулах уургийг илэрхийлдэг SW620 эсийг вирусын дамжуулалтаар олж авсан.Өөрчлөгдсөн SW620 эсүүд нь 0.1-0.3-ийн MOI-д дөрвөн бие даасан халдварын туршилтаар вирусын номын сангаар халдварлагдсан бөгөөд 2 мкг/мл пуромицин (Сигма, Сент Луис, МО) -аар 2 өдрийн турш дээж авсан.Дараа нь скрининг хийх зорилгоор хамгийн багадаа 500 эс/сгРНХ-ийн номын сангийн хамрах хүрээтэй эсийг 18 хоногийн турш in vitro өсгөвөрлөв.
Геномын ДНХ-ийг QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183) зааврын дагуу гаргаж авсан.Номын санг барихад биологийн давталт бүрт 100 мкг геномын ДНХ ашигласан.sgRNA бүсийг хоёр удаагийн ПГУ-аар олшруулж, зураасан кодтой холбосон.
ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг NucleoSpin® гель болон ПГУ-ын цэвэршүүлэх иж бүрдэл (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) ашиглан цэвэршүүлж, Qubit™ HS хоёр хэлхээтэй ДНХ илрүүлэх хэрэгсэл (Thermo Fisher Scientific; Q32854) ашиглан хэмжилт хийсэн.
MTS шинжилгээг эсийн өсөлтийг хэмжихэд ашигласан.2000 эс/худны анхны нягттай 96 цооногийн ялтсуудад эсүүдийг суулгасан.Харьцангуй эсийн тоог заасан хугацаанд өдөр бүр нийт 4-6 хоногийн турш хэмжсэн.Худаг тус бүрийн хувьд 20 мкл MTS урвалж (Промега) 100 мкл DMEM-ээр шингэлж, 370С-т 4 цагийн турш эсүүдтэй хамт өсгөвөрлөж, дараа нь OD490 хэмжинэ.
Бөмбөрцөг үүсэхэд дүн шинжилгээ хийснээр зангуугүй өсөлтийн хүчин чадлыг олж илрүүлсэн.Товчхондоо, shRNA DARS-AS1 буюу хяналтын shRNA-тай 2000 эсийг 4 хоног тутам дунд зэргийн өөрчлөлттэй хэт бага бэхэлгээтэй микроплатад (Корнинг) өсгөвөрлөв.Бөмбөрцөгийг 14 хоногийн дараа тоолсон.Сайжруулах шинжилгээнд DARS-AS1 хэт экспрессийн плазмид эсвэл хяналтын плазмидаар дамжуулагдсан 500 эсийг ашигласан, эс тэгвээс арга өөрчлөгдөөгүй.
Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440)-ийн зааврын дагуу T7 РНХ полимераз ба биотин-16-UTP (Roche 1138908910) ашиглан РНХ-г хуулбарласан.Энд ашигласан праймеруудыг нэмэлт хүснэгт 4-т жагсаав.
Уургийн кодлогч PACT эсвэл PKR мужуудыг pET15b (Addgene #73619) болгон хувилж, BL21(DE3) болгон хувиргасан.Бактерийг ампициллин агуулсан LB-д шөнийн турш өсгөвөрлөж, дараа нь шинэ LB-ээр 100 дахин шингэлэв.Дунд зэргийн OD600 нь 0.8 хүрэхэд уургийн илэрхийлэлийг өдөөх зорилгоор 1 мМ IPTG нэмсэн.Шөнийн турш зөөлөн сэгсэрсний дараа (20°С-т 250 эрг/мин) эсийн үрлийг центрифуг (4000 эрг/мин, 10 мин, 4°С) цуглуулсан.Эсийн үрлийг лизисын буферт (50 мМ Tris, рН 8.0, 250 мм NaCl, 1 мМ PMSF) дахин түдгэлзүүлж, мөсөн дээр 30 минутын турш өсгөвөрлөж, дараа нь sonicate (15 минут, 5 секундын турш асаах/унтраах, мөсөн дээр) болон центрифуг (13,0000) хийнэ. rpm)., 30 мин, 4°С).Дараа нь дээд давхаргыг Ni-NTA давирхайд (QIAGEN) 40С-т 3 удаа ачиж, угаах буфер (50 мМ Tris, рН 8.0, 40 мМ имидазол, 250 мм NaCl) -аар 4 удаа угааж, нийт 3 удаа угаана. 10 мл ялгаруулагч буфер (50 мм Tris, рН 8.0, 250 мм NaCl, 300 мм имидазол).Цэвэршүүлсэн уургийг WB ашиглан тодорхойлж, концентрацийг Qubit™ уургийн шинжилгээний иж бүрдэл (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) ашиглан тодорхойлсон.
RIP шинжилгээг өмнө нь тайлбарласны дагуу өөрчлөлт оруулан гүйцэтгэсэн.Товчхондоо, 1x RIP буфер (25 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 100 мМ NaCl, 0.5% NP-40, RNasin рибонуклеаза дарангуйлагч (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 мМ DDM, протеаз) xtostatics 7cys-ийн задралыг задалдаг. (Roche, 1 mM DTT) ба 4 ° C-т 15 минутын турш 13,000 эрг / мин-д центрифуг хийнэ.Дараа нь супернатантыг 5 мкг анти-PACT эсрэгбие (Abeam) эсвэл IgG (CST) холбосон уураг A+G соронзон бөмбөлгүүдийг (Millipore) -аар өсгөвөрлөсөн.Бөмбөлгүүдийг 5 удаа RIP буферээр угааж, дараа нь протеиназа K (NEB) -ээр шингэв.РНХ-ийг Тризолоор гаргаж аваад RT-qPCR-ээр тодорхойлно.Праймеруудыг нэмэлт 5-р хүснэгтэд үзүүлэв.
In vitro RIP шинжилгээг өөрчилсөн стандарт RIP шинжилгээний протоколын дагуу хийсэн.Нийт 5 pmol in vitro транскрипц хийсэн РНХ-ийг RIP буферээр 1 дахин шингэлж, 65°С-т 5 минутын турш инкубацид байлгасны дараа өрөөний температур хүртэл удаан хөргөнө.Нийт 5 pmol бүрэн бүтэн буюу мутацид орсон туг шошготой PACT уургийг E. coli-аас цэвэршүүлсэн.Ренатуржуулсан РНХ-ийг 4°С-т 2 цагийн турш өсгөвөрлөж, далбааны эсрэг IP-ийн RIP шинжилгээнд дээрх процедурыг мөрдөнө.
РНХ-ийн өргөтгөлийн шинжилгээнд 1x107 эсийг 1xRIP буферээр задалсан.4°С-т 15 минутын турш 13,000 эрг/мин-д центрифуг хийсний дараа дээд давхаргыг 30 мкл стрептавидины соронзон судалтай (Бекман) 4°С-т 2 цагийн турш урьдчилан боловсруулав.Дараа нь цэвэршүүлсэн лизатыг мөөгөнцрийн tRNA-тай нийлүүлж, 40 пмоль нөхөн төлжүүлсэн РНХ-ээр нэг шөнийн дотор 4°С-т өсгөвөрлөсний дараа дахин 2 цагийн турш BSA-аар хаагдсан 20 мкл шинэ стрептавидины соронзон бөмбөлгүүдийг нэмсэн.Угаах үе шат нь 5x RIP буфертэй 4 удаа, 1x RIP буфертэй 4 удаа хийгдсэн.Харгалзах уурагуудыг биотин элюцийн буфер (25 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 12.5 мМ D-биотин, PMSF) -аар ялгаж, NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) дээр салгав.Мөнгө будсаны дараа (Beyotime Biotechnology) тодорхой туузыг хасаж, MS шинжилгээнд хамруулсан.
PACT болон PKR хоорондын харилцан үйлчлэлийг шалгахын тулд Co-IP шинжилгээ хийсэн.Товчхондоо, 1 х 107 задарсан эсийг 1 x RIP буферт өсгөвөрлөж, дараа нь 13,000 эрг/мин-д 4°С-т 15 минутын турш центрифуг хийж, дээд давхаргын лизатуудыг бэлтгэсэн.Лизатуудыг уураг A + G соронзон бөмбөлгүүдийгээр дүүргэж, 5 мкг эсрэг PACT эсрэгбиетэй холбож, шөнийн турш 4 хэмд зөөлөн эргүүлэв.Бөмбөлгүүдийг 5 × RIP буферээр 3 удаа, 1 × RIP буферээр хоёр удаа угааж, 1 × SDS буферээр цэвэрлэв.Сэргээгдсэн уургийг SDS-PAGE гелээр шинжилж, ДБ илрүүлсэн.
Хоёр pmol дарцагтай PACT болон 1 pmol PKR гэдэсний савханцараас цэвэршүүлсэн.1 × RIP буферт шингэлж, 10 pmol шинэчлэгдсэн РНХ-ийг 4 ° C-т 2 цагийн турш өсгөвөрлөнө.Үүний дараа тэдгээрийг A+G уурагтай соронзон ирмэгээр холбосон эсрэг шошготой эсрэгбиемээр нэмэлт хоёр цагийн турш өсгөвөрлөсөн.Дараа нь бөмбөлгүүдийг дөрвөн удаа 1x RIP буферээр угааж, 1x SDS буферээр цэвэрлэв.Үүссэн PACT болон PKR-ийг ДБ илрүүлсэн.